1. UKM Learning and Research Repository
2. PHD Thesis / Tesis PHD
3. Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Title:	Kaedah ecoTILLING untuk mengesan polimorfisme pada gen-gen terpilih dalam sawit
Authors:	Salwa Abdullah Sirajuddin (P48198)
Supervisor:	Che Radziah Che Mohd Zain, Dr.
Keywords:	Ecotiling Polimorfisme Palms - Malaysia
Issue Date:	25-Sep-2014
Description:	Sejak akhir-akhir ini, variasi jujukan nukleotida telah digunakan untuk menambahbaik sesuatu tanaman yang mana ianya boleh dikesan dan dikenal pasti menggunakan pelbagai kaedah yang berbeza. Salah satu kaedah terkini dalam penambahbaikan tanaman ialah dengan mengeksploitasi variasi DNA yang wujud secara spontan yang dikenali sebagai EcoTILLING. Kaedah EcoTILLING dilihat amat berpotensi untuk diaplikasikan dalam sawit yang heterogen kerana mutasi resesif boleh tersembunyi dalam genotip heterozigot dan berlakunya keadaan inbreeding depression terhadap kehadiran alel mutan. Walau bagaimanapun, kaedah EcoTILLING biasa yang menggunakan pencetus berlabel dalam amplifikasi PCR, enzim CEL I dan alat Li-Cor 4300 DNA Analysis System memerlukan kos yang tinggi untuk dilaksanakan. Justeru, tujuan kajian ini dilakukan ialah untuk mengaplikasikan kaedah EcoTILLING yang diubah suai bagi menyaring dan mengesan polimorfisme DNA pada gen-gen yang diminati. Langkah-langkah utama kaedah EcoTILLING terubah suai ialah amplifikasi PCR menggunakan pencetus tidak berlabel, diikuti dengan penyahaslian dan penyepuhan lindap semula sampel untuk membentuk DNA heterodupleks yang bertindak sebagai substrat dalam pencernaan menggunakan SURVEYOR Nuclease dan akhirnya, produk-produk pencernaan yang mewakili polimorfisme dicerap melalui elektroforesis gel agarosa. Maka, teknik PCR adalah amat penting sebelum langkah seterusnya boleh dijalankan. Analisis pengoptimuman protokol PCR yang dilakukan ialah pembentukan dan pemilihan pencetus, komponen dan keadaan tindak balas untuk mendapatkan produk PCR tunggal serta spesifik. Di samping itu, langkah-langkah rawatan dengan SURVEYOR Nuclease juga dioptimumkan untuk memudahkan pencerapan produk-produk pencernaan pada gel agarosa. Kemudian, penyaringan dan pengesanan polimorfisme pada dua gen terpilih dalam sawit menggunakan protokol EcoTILLING terubah suai dijalankan. Sebanyak dua kumpulan polimorfisme pada fragmen gen GA 2-oksidase 2 dan tujuh kumpulan polimorfisme bagi fragmen gen delta 9-stearoil desaturase telah dapat dikenal pasti. Hasil PCR yang dikehendaki kemudiannya diklonkan dan dijujuk untuk mencirikan jenis dan tapak spesifik polimorfisme berkenaan. Analisis hasil penjujukan menunjukkan terdapat 26 SNPs dan 19 INDELs bertaburan pada keseluruhan fragmen gen GA 2-oksidase 2 dalam E. guineensis var. tenera manakala dalam E. oleifera, kehadiran 48 SNPs dan 21 INDELs telah dapat dikesan pada fragmen gen yang sama. Sementara itu, kewujudan 28 SNPs dan 14 INDELs dalam E. guineensis var. tenera sedangkan dalam E. oleifera pula sebanyak 15 SNPs dan 8 INDELs telah didapati pada fragmen gen delta 9-stearoil desaturase. Kedua-dua hasil tersebut adalah selaras dengan hasil pencernaan menggunakan SURVEYOR Nuclease. Justeru, kaedah ini dilihat berpotensi untuk diaplikasikan dalam kajian berkaitan yang seterusnya bagi mengesan dan mengenal pasti variasi nukleotida secara semula jadi atau diaruh menggunakan platform pengesanan yang mudah, mampu milik dan paling asas tanpa perlu bergantung kepada alat-alat spesifik atau high-throughput dan kos yang tinggi terutamanya di Malaysia. Seterusnya, analisis PCR kualitatif real time TaqMan SNPs/Diskriminasi Alel bagi fragmen gen GA 2-oksidase 2 dan pengasaian satu tiub PCR atau PCR multipleks untuk fragmen gen delta 9-stearoil desaturase telah dapat mengesahkan hasil polimorfisme DNA tertentu yang telah dikesan dan dicirikan sebelum ini adalah polimorfisme sebenar dan bukannya disebabkan oleh false positive.,Recently, nucleotide sequence variation has been used to improve crops which can be detected and identified through several different methods. One of the recent methods to improve crops by exploiting the natural variation that exists from spontaneous mutation is called EcoTILLING. EcoTILLING may work well in heterogeneous oil palm, where recessive mutations are likely to be hidden in the heterozygous genotypes and observed during inbreeding depression arguing for the presence of mutant alleles. Nevertheless, standard EcoTILLING method relies largely on labeled primers, CEL I nuclease and electrophoretic gels, namely the Li-Cor 4300 DNA Analysis System which is costly to perform. Hence, the purpose of this study was to adopt a modified EcoTILLING method for detection of DNA polymorphisms in the desired genes. The outline of a modified EcoTILLING method was as follows: PCR amplifications of target regions using unlabeled primers, then samples are denatured and reannealed to form heteroduplexes that become the substrate for enzymatic mismatch cleavage using SURVEYOR Nuclease and finally cleaved bands representing polymorphisms are visualized using standard agarose gel electrophoresis. Therefore, PCR technique is crucial before downstream analyses can be performed. The optimization analyses of PCR protocol involved a primer design and selection, PCR components and conditions to get the correct single amplified product. Besides, SURVEYOR Nuclease treatment steps were also optimized to reduce background noise for easier observation of cleavaged products on agarose gel. Then, screening and detection of polymorphisms in two selected genes in oil palm using a modified EcoTILLING protocol was performed. Approximately two polymorphism groups for GA 2-oxidase 2 gene fragment and seven polymorphism groups for delta 9-stearoyl desaturase gene fragment were identified. The desired PCR products were then cloned and sequenced to characterize the specific type and site of the polymorphism. Sequence analyses revealed that there were 26 SNPs and 19 INDELs scattered in GA 2-oxidase 2 gene fragment in E. guineensis var. tenera whereas in E. oleifera, the presence of 48 SNPs and 21 INDELs were detected in the same gene fragment. Meanwhile, the existence of 28 SNPs and 14 INDELs in E. guineensis var. tenera whilst 15 SNPs and 8 INDELs in E. oleifera were discovered in delta 9-stearoyl desaturase gene fragment. Both results were conformed by SURVEYOR Nuclease digestion results. Hence, this method will be very valuable for its implementation in subsequent related studies to uncover naturally occurring or induced nucleotide variations using a simple, affordable and common mean of detection platform devoid of liable on any specific or high-throughput equipment and high costs especially in Malaysia. Subsequently, a qualitative real time PCR TaqMan SNPs/Allele Discrimination for GA 2-oxidase 2 gene fragment and a single tube PCR assay or multiplex PCR for delta 9-stearoyl desaturase gene fragment analyses have positively validated that certain DNA polymorphisms detected and characterized earlier are true polymorphisms instead of false positive.,PhD
Pages:	392
Call Number:	QK495.P17S235 2015 tesis
Publisher:	UKM, Bangi
Appears in Collections:	Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.