Kesan perlakuan y-tokotrienol dan a-tokoferol ke atas langkah pengisyaratan transduksi dalam sel kanser hepar

Abstract

Kesan perlakuan dua vitamin E kelapa sawit, y-tokotrienol (GTT) dan a-tokoferol (ATF) ke atas sel kanser hepar HepG2 telah dikaji. Dua kaedah penyediaan vitamin E (0-750 μM) sebagai rawatan ke atas sel telah digunakan iaitu vitamin E tanpa dan dengan preinkubasi serum anak lembu (FCS). Kandungan vitamin E, perubahan viabiliti, proliferasi, sitotoksisiti dan apoptosis sel ditentukan. Perubahan ekspresi, fosforilasi dan aktiviti protein-protein yang terlibat di dalam tapak jalan proliferasi dan apoptosis turut diselidik bagi memperincikan mekanisme tindakan vitamin E tersebut. Perlakuan GTT dan ATF tanpa preinkubasi dengan FCS (nGTT dan nATF) tidak mengubah kadar viabiliti atau sitotoksisiti sel HepG2. GTT dengan preinkubasi FCS (iGTT) didapati telah merencatkan 50% viabiliti sel pada dos 153 μM dan meningkatkan sitotoksisiti manakala perlakuan ATF dengan preinkubasi FCS (ATF) pula hanya berjaya menurunkan sedikit (16%) kadar viabiliti sel HepG2. Paras proliferasi sel telah direncatkan oleh kedua-dua nGTT dan nATF dengan ICso 582 μM bagi nGTT dan IC40 500 μM bagi nATF. iGTT pula memberikan kesan yang lebih ketara iaitu dengan ICso 134 μM sedangkan iATF menghasilkan kesan antiproliferasi yang setara dengan nATF. Penentuan kadar fragmentasi DNA secara ELISA menunjukkan kadar apoptosis ditingkatkan sebanyak 7 kali ganda hasil perlakuan 150 μM nGTT manakala 3 kali ganda bagi nATF pada kepekatan 300 μM. Menariknya, perlakuan iGTT menghasilkan kadar peningkatan apoptosis yang sama manakala iATF langsung tidak mengubah kadar apoptosis. Namun secara morfologi, perlakuan iGTT mengakibatkan bilangan sel apoptosis yang paling tinggi (93%) berbanding perlakuan nGTT (24%), nATF (15% ) atau iATF yang lagsung tidak sekali-kali menunjukkan ciri-ciri sel yang mengalami apoptosis. Keputusan morfologi ini adalah seiring dengan penentuan apoptosis secara elektroforesis gel agaros yang menghasilkan anak tangga DNA apabila berlaku apoptosis. Kajian HPLC menunjukkan preinkubasi FCS meningkatkan kandungan GTT di dalam sel sehingga 113 kali ganda manakala ATF hanya ditingkatkan sebanyak 14 kali ganda. Kandungan GTT yang banyak di dalam sel mungkin menyebabkan kesan iGTT yang paling hebat berbanding yang lain. Bagi mengenalpasti mekanisme tindakan vitamin E, perubahan di dalam pengisyaratan transduksi dikenalpasti. Perlakuan nGTT dan nATF meningkatkan aktiviti keseluruhan/total enzim tirosin kinase sebanyak 18% dan 9% masing-masing manakala peningkatan akibat perlakuan iGTT adalah amat besar iaitu 286%. Ekspresi protein ERK1 dan MEK2 pula diturunkan setelah 6 jam perlakuan nGTT dan nATF. Manakala ekspresi protein kinase Ca matang ditingkatkan pada perlakuan 12-dan 24-jam. Malangnya kadar pengaktifan yang dikesan menerusi kadar fosforilasi protein didapati tidak berubah. Protein-protein lain yang didapati tidak berubah dari segi ekspresi adalah STAT3, JNK, p38, ras, Jun, Fas, p53, c-Myc, Bc12, Bax, kaspase 3 dan kaspase 8. Seterusnya, perlakuan iGTT tidak mengubah mana- mana protein yang dikaji melainkan p53 dan kaspase 8 yang ekspresinya ditingkatkan mulai 15 minit dan 2 jam masing-masing. Sejajar dengan perubahan ekspresi, aktiviti kaspase 8 didapati meningkat sebanyak 2.6-kali selepas perlakuan 3-jam dan memuncak sehingga 3.3 kali ganda pada perlakuan 12-jam. Perubahan-perubahan ini mencadangkan bahawa iGTT mengaruhkan apoptosis dengan pengaktifan pangkal pengisyaratan transduksi dan bukan pada hujungnya. Kesimpulannya, kesan antiproliferasi GTT yang melibatkan pengaruhan apoptosis adalah lebih ketara berbanding ATF dan preinkubasi dengan FCS menggandakan kesan GTT tersebut. Penentuan kepekatan GTT yang optima bagi merencatkan sel kanser secara spesifik adalah kritikal dan perlu dikaji.