Pengeklonan, pengekspresan dan pencirian enzim asid karboksilik reduktase (CAR) daripada kulat Trichoderma virens

Abstract

Teknologi hijau seperti penggunaan enzim dalam penghasilan bahan kimia secara mampan semakin diberi perhatian agar matlamat global untuk pembangunan mampan melalui inisiatif Matlamat Pembangunan Mampan (SDG) boleh dicapai. Keadaan ini menggalakkan penemuan dan pembangunan enzim baharu seperti asid karboksilik reduktase (CAR) untuk mensintesis bahan sintetik. CAR merupakan enzim yang memangkin penurunan asid karboksilik kepada aldehid dalam keadaan sederhana. Oleh itu, matlamat yang ingin dicapai dalam penyelidikan ini adalah penemuan dan pengekspresan enzim CAR baharu daripada kulat askomisit, Trichoderma virens. Lima gen putatif yang mengekod CAR dikenal pasti melalui kaedah perlombongan genom, diklon dan diekspres. Walau bagaimanapun, hanya Tvircar2 (1049 a.a.) berjaya diekspres dengan baik dan dipilih untuk dicirikan selanjutnya. Analisis pengkomputeran melalui pangkalan data AntiSMASH menunjukkan bahawa Tvircar2 merupakan sebahagian daripada kelompok gen yang menghasilkan terpenoid. Kelompok gen ini mempunyai persamaan dengan kelompok gen ilicicolina B daripada Stachybotrys bisbyi dan kelompok gen askoklorina daripada Acremonium egyptiacium. Tvircar2 juga dikenal pasti mengekod enzim CAR dengan indeks hidrofobik yang tinggi melalui pengiraan program Grand Average Hydropathicity (GRAVY). TvirCAR2 berjaya diekspres dengan banyak dalam bentuk protein larut dan protein tidak larut menggunakan hos pengekspresan Escherichia coli BL21 STAR (DE3). Gliserol ditambah dalam penimbal untuk meningkatkan keterlarutan TvirCAR semasa proses penulenan dan asai enzim. TvirCAR2 ditulenkan melalui kaedah penulenan Kromatografi Afiniti Ion Logam Tidak Bergerak (IMAC) dan Kromatografi Penyisihan Saiz (SEC). Protein TvirCAR2 yang ditulenkan, dengan berat molekul sekitar 130 kDa, disahkan melalui kaedah analisis SDS-PAGE. Saringan substrat dilakukan melalui kaedah pengedokan molekul ke atas model struktur TvirCAR2 yang diramal dan kaedah biotransformasi ke atas kulat Trichoderma virens. Saringan biotransformasi T. virens menunjukkan asid vanilik dan asid ferulik diturunkan kepada aldehid masing-masing. Pengedokan molekul menggunakan struktur yang diramal oleh AlphaFold2 dan disahkan menggunakan plot Ramachandran menunjukkan asid benzoik sesuai digunakan dalam asai enzim TvirCAR2. Walau bagaimanapun, aktiviti enzim untuk TvirCAR2 menggunakan asai penyusutan NADPH adalah rendah, iaitu 0.02 µmol/min/mg pada keadaan optimum. Kajian lanjut seperti pengekspresan Tvircar2 bersama gen lain dalam kelompok gen yang sama dicadangkan untuk meningkatkan kecekapan protein tersebut.