Transformasi genetik OAK 1 ke dalam padi untuk kerintangan terhadap siput gondang (Pomacea canaliculata)

Abstract

Siklotida kalata B1 (kB1) yang dikodkan oleh gen Oak 1 merupakan peptida yang mempunyai ikatan disulfida siklik yang stabil terhadap kimia dan haba. Ianya mempunyai sifat farmaseutikal dan racun makhluk perosak. Penemuan siklotida daripada tumbuhan Afrika iaitu Oldenlandia affinis (Rubiceae), telah dilaporkan dapat menghalang aktiviti molusksida terhadap siput gondang. Terdapat laporan yang telah berjaya memasukkan gen Oak 1 ke dalam tumbuhan bukan siklik, dan boleh menghasilkan padi transgenik yang mampu menghasilkan protein siklotida terhadap siput tersebut. Dalam kajian ini, prestasi gen Oak 1 dinilai dalam kultivar Malaysia MR 219 melalui transformasi berperantarakan Agrobacterium. Pengekodan jujukan penuh DNA Oak 1 disintesis secara kimia dan diamplifikasikan dengan menggunakan dua pencetus spesifik. Gen Oak 1 diklonkan ke dalam vektor pCAMBIA1301 di bawah kawalan promoter Ubiquitin Zea mays. Plasmid ini kemudiannya dimasukkan ke dalam kalus padi embriogenik dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Transforman kalus telah dipilih melalui media pemilihan mengandungi higromysin 25 mg/L yang dilakukan setiap dua minggu. Kemudian transforman dipindahkan ke media regenerasi yang mengandungi higromysin 50 mg/L yang dilakukan setiap dua minggu. Pokok yang telah digenerasi dianalisis dengan ujian tindak balas rantai polimerase (PCR) dan kuantitatif tindak balas polimerase qPCR. Padi transgenik menunjukkan terdapat perbezaan ketara dalam bilangan biji dan daun berbanding dengan padi kawalan. Ujian bio asai aktiviti moluska telah dijalankan dengan memberi makan kepada anak siput dengan kepekatan ekstrak padi transgenik yang berbeza. Ekstrak kasar daripada padi transgenik telah menunjukkan terdapat aktiviti molusksida ke atas siput yang telah dibandingkan dengan molusksida sintetik, metaldehid. Pada kepekatan 10 mg/mL ekstrak kasar padi transgenik menunjukkan 100% kematian siput selepas 120 jam pengeraman. Jujukan sintetik gen Oak 1 diklon di dalam vektor pengekspresan pET-32b dan dalam bingkai yang mempunyai gen thioredoxin 6X histidin. Protein yang dilakurkan diekspreskan dalam hos bakteria, E.coli strain BL21 (DE3). Protein rekombinan kB1 dipencilkan melalui kromatografi afiniti menggunakan kolum sepharose nikel. Analisis nuclear magnetic resonance (NMR) telah dijalankan dan menunjukkan protein rekombinan kB1 didapati dalam bentuk bukan siklik (linear). Analisis bagi menentukan sama ada terdapat aktiviti moluksida pada ekstrak kasar protein rekombinan kB1 terhadap siput gondang emas (SGE) turut dijalankan. Pada kepekatan 400 – 500 µg/mL ekstrak kasar protein rekombinan kB1 telah menunjukkan 100% kematian SGE. Keupayaan menghasilkan padi termodifikasi yang mengandungi kB1 mempunyai potensi untuk mengatasi masalah ancaman SGE di sawah padi dan seterusnya dapat mengurangkan kesan toksik racun kimia molusksida ke atas alam sekitar dan ekosistem.