Pencirian fungsi protein hipotetik BPSL1038 dan BPSL1038a daripada Burkholderia Pseudomallei K96243

Abstract

Burkholderia pseudomallei ialah satu patogen oportunis yang menyebabkan penyakit melioidosis. Jujukan genom penuh untuk strain K96243 bagi patogen ini menunjukkan 25% daripada jujukan DNA berkodnya (CDS) dianotasi sebagai protein hipotetik. Di antara protein hipotetik tersebut, jujukan gen bpsl1038 ditemukan terpelihara merentasi pelbagai spesis di dalam famili Burkholderiaceae. Bersebelahan dengannya, gen bpsl1038a pula ditemukan terpelihara dalam spesis Burkholderia yang dilaporkan berpatogen kepada manusia atau tumbuhan sahaja. Struktur tiga-dimensi (3D) protein rekombinan BPSL1038 (PDB ID: 7VXR) ini mempunyai persamaan kepada nuklease CRISPR/Cas2 dan toksin-antitoksin (TA)/VapD. Maklumat ini mencadangkan potensi protein hipotetik BPSL1038 dan BPSL1038a berfungsi di bawah satu sistem dan mungkin terlibat dengan sifat kepatogenan B. pseudomallei. Walaubagaimanapun, fungsi bagi kedua-dua protein hipotetik ini masih belum dikaji sepenuhnya. Justeru, kajian ini bertujuan untuk mencirikan fungsi kedua protein hipotetik tersebut berpandukan struktur 3D dan analisis proteomik. Pengekspresan protein rekombinan BPSL1038 (rBPSL1038) dan BPSL1038a (rBPSL1038a) dihasilkan menggunakan sistem pengekspresan protein rekombinan Escherichia coli. Pencirian fungsi protein rBPSL1038 dijalankan menggunakan asai nuklease secara in vitro berpandukan kajian asai enzim Cas2. Pencirian protein hipotetik BPSL1038a pula dilakukan dengan menganalisis jujukan asid amino dan meramal struktur 3D secara ab initio. Selain itu, penempatan subsel bagi protein hipotetik BPSL1038 dan BPSL1038a secara natif di dalam sel B. pseudomallei K96243 ditentukan menggunakan pendekatan proteomik subsel. Pengenalpastian protein natif B. pseudomallei K96243 di dalam fraksi sitoplasma, periplasma dan membran kemudiannya dihantar untuk pengenalpastian protein menggunakan LC-MS/MS. Dapatan kajian ini menemukan bahawa protein rekombinan BPSL1038 (rBPSL1038) merupakan enzim endonuklease yang mampu mencerna dsDNA, dengan keutamaan kepada substrat produk PCR berbanding DNA plasmid. Pencirian biokimia menemukan aktiviti enzim nuklease rBPSL1038 ini optimum dengan kehadiran garam monovalen (NaCl dan KCl) kurang daripada 100 mM di dalam penimbal MES monohidrat pH 6. Tambahan lagi, protein rBPSL1038 ini juga tidak memerlukan ko-faktor kation logam dwivalen untuk aktiviti nukleasenya. Protein rekombinan BPSL1038a tidak berjaya diekspres dalam kajian ini. Model ramalan struktur 3D bagi protein BPSL1038a ini juga tidak dapat menghasilkan model yang berkeyakinan tinggi. Terakhir sekali, melalui kajian proteomik subsel B. pseudomallei K96243, protein hipotetik BPSL1038 dikenalpasti di dalam fraksi membran sahaja, manakala protein hipotetik BPSL1038a tidak ditemui. Kesimpulannya, dapatan daripada kajian ini terhadap protein BPSL1038 dan BPSL1038a telah menyumbang kepada pengetahuan yang penting dalam memahami sifat kepatogenan Burkholderia pseudomallei.