Pembinaan ujian aliran sisi (LFA) berasaskan DNA untuk mengenal pasti mutasi E101K pada gen LDLR bagi hiperkolesterolemia famili (FH)

Abstract

Beberapa kaedah boleh digunakan untuk mengenal pasti polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) seperti analisis ujian berasaskan tindak balas berantai polimerase (PCR) serta penjujukan genom, genotip menggunakan kaedah MassARRAY® dan mikroatur melalui hibridisasi DNA. Walau bagaimanapun, kaedah ini memakan masa yang lama dan memerlukan peralatan yang mahal yang hanya terdapat di makmal tertentu. Ujian aliran sisi (LFA) telah digunakan sebagai ujian titik penjagaan atau point of care testing bagi pelbagai penyakit. Projek ini bertujuan untuk membangunkan ujian aliran sisi (LFA) berasaskan DNA sebagai alat diagnostik titik penjagaan untuk genotip. Ujian LFA telah direka bagi mengenal pasti mutasi salah erti, E101K, yang mengakibatkan perubahan nukleotida tunggal daripada G kepada A pada ekson 3 gen LDLR dan menyebabkan Hiperkolesterolemia Famili (FH), telah digunakan sebagai model pengesanan. Sampel darah telah dikumpulkan daripada individu hiperkolesterolemia (n=103) daripada projek The Malaysian Cohort manakala sampel kawalan normal (n=60) daripada Biobank, PPUKM-UMBI. DNA telah diekstrak daripada sampel darah tersebut dan seterusnya proses amplifikasi PCR telah dilakukan dengan menggunakan pencetus berlabel dwifungsi khusus bagi membezakan di antara DNA jenis normal dan mutan. Bagi pengesanan mutasi, produk PCR telah diletakkan di atas membran dan pengesanan visual pada LFA telah dilakukan dengan melihat kepada jalur yang terdapat pada membran. Kaedah Penjujukan Sanger telah dilakukan bagi mengesahkan kehadiran mutasi E101K. Sensitiviti dan spesifisiti kaedah LFA telah ditentukan melalui pengesahan mutasi pada semua sampel kajian menggunakan kaedah Agena MassARRAY®. Daripada 103 individu hiperkolesterolemia, 5 individu (4.8%) telah dikesan positif bagi mutasi E101K dengan menggunakan kesemua teknik, yang melibatkan kaedah LFA, penjujukan Sanger, dan Agena MassARRAY®. Individu ini diklasifikasikan sebagai FH pasti, kerana diagnosis DNA telah disahkan. Sensitiviti dan spesifisiti pengesanan mutasi oleh LFA adalah 100% dibandingkan dengan keputusan genotip menggunakan kaedah Agena MassARRAY®. Kesimpulannya, kaedah LFA telah berjaya dibina dan ianya berpotensi menjadi ujian titik penjagaan bagi penyakit lain. Ia juga boleh digunakan untuk penyaringan ahli keluarga bagi mengesan mutasi E101K pada gen LDLR.