Pembangunan kaedah pengesanan varian dna mitokondria menggunakan PCR khusus alel untuk identifikasi manusia dalam kalangan subpopulasi Melayu di Universiti Kebangsaan Malaysia

Abstract

SNP mitokondria (mtSNP) ialah salah satu penanda genetik yang digunakan untuk identifikasi mangsa bencana dalam siasatan forensik. Kajian ini dijalankan bertujuan untuk membina lebih banyak lokus SNP khususnya melibatkan subpopulasi Melayu dengan teknik PCR khusus alel (AS-PCR). Teknik ini dapat mengesan mutasi mtSNP tanpa memerlukan proses penjujukan dan boleh digunakan untuk mengklasifikasi populasi mangsa sebelum identifikasi individu. Terdapat dua tahap reaksi rantai polimerase iaitu PCR pusingan pertama telah digunakan untuk menghasilkan fragmen mtDNA dengan panjang templat dari 250 pb hingga 450 pb yang merangkumi lokasi SNP dipilih. Pencetus fragmen mtDNA yang khusus kepada manusia telah disahkan dahulu dengan sampel bukan manusia dari kelas bakteria, mamalia dan serangga. Seterusnya, pencetus khusus alel (AS) dibina untuk PCR pusingan kedua telah bergabung dengan alel sasaran berdasarkan sintensis pencetus dari arah 3’. Kehadiran alel sebenar atau mutan diperhatikan melalui sinaran UV selepas elektroforesis gel agarosa. Pencetus khusus alel dan kawalan positif dalaman yang dioptimumkan telah disahkan menggunakan 105 sampel bukal daripada subpopulasi Melayu di Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM). Sebanyak dua belas fragmen mtDNA daripada PCR pusingan pertama telah digunakan sebagai templat untuk membangunkan 20 mtSNP untuk AS-PCR. Validasi pencetus mtDNA manusia dengan sampel bukan manusia menunjukkan ketidakspesifikan 100% (n = 12) terhadap sampel Macaca fascicularis (kera), Spiniphora genitalis (larva), Formicidae (semut) dan 83.3% (n=2; 10/12) sampel Escherichia coli (E.coli), Staphylococcus aureus (S.aureus), Canis lupus familiaris (anjing), Felis catus (kucing). Malah, optimasi suhu penyepuhlindapan (Ta) telah mengelakkan kekhususan pencetus tersebut sehingga 100% terhadap semua sampel bukan manusia. Selepas itu, pencetus khusus alel untuk 19 mtSNP telah berjaya membezakan kehadiran alel sebenar dan mutan untuk setiap sampel Melayu. Keduadua tindak balas PCR telah dioptimumkan pada 30 pusingan PCR dalam keadaan kitaran terma yang sama iaitu 94°C dalam masa 5 minit (denaturasi awal), 94°C dalam 30 saat (denaturasi akhir), Ta dalam 30 saat (penyepuhlindapan), 72°C dalam 30 saat (pemanjangan awal) dan 72 °C dalam 5 minit (pemanjangan akhir). Parameter yang dioptimumkan telah mengesan amplikon serendah 87 pb dengan intensiti jalur tinggi. Kesimpulannya, kit penaipan mtDNA ini berupaya mempercepatkan dan menjimatkan kos analisis sampel dalam identifikasi mangsa bencana yang melibatkan subpopulasi Melayu.