DSpace Collection:

Pemahaman tentang kesan vesikel ekstrasel yang telah diaruh kemoterapi terhadap sel imun manusia

2021-08-23T00:00:00Z

Title: Pemahaman tentang kesan vesikel ekstrasel yang telah diaruh kemoterapi terhadap sel imun manusia Authors: Nur' Syahada Ab. Razak Abstract: Kanser usus adalah sejenis kanser yang berlaku di bahagian usus dan rektum manusia dan merupakan antara kanser yang paling lazim dihidapi oleh masyarakat dunia termasuk rakyat Malaysia. Seiring dengan pembedahan, kemoterapi menjadi pilihan para doktor dalam merawat pesakit kanser usus. Antara ubat kemoterapi yang diberikan adalah ubat berasaskan platinum seperti oxaliplatin yang diperakui sebagai piawai rawatan kanser usus di seluruh dunia termasuk Malaysia. Agen genotoksik ini mempunyai kesan sitotoksik secara langsung kepada sel kanser seperti mengubah DNA, menghalang pembahagian dan pertumbuhan sel serta mampu mendorong kematian sel imunogenik (ICD). Selain itu, ubat kemoterapi ini juga mampu mengubah homeostasis di dalam badan manusia dan memberi kesan kepada sistem imun. Namun, kita masih belum memahami secara sepenuhnya hubung kait antara ubat kemoterapi dengan persekitaran mikro tumor terutamanya terhadap sel imun. Umum telah diketahui, sel – sel manusia boleh merembes keluar vesikel ekstrasel (EV) yang bersaiz nano sebagai medium berkomunikasi antara sel. Entiti ini juga mampu mengubah dan memberikan tindak balas terhadap sel - sel dalam persekitaran mikro tumor. Oleh itu, di dalam kajian ini, kami cuba untuk memahami kesan EV yang telah diaruh oleh kemoterapi terhadap sel imun manusia, terutamanya sel limfosit T CD8+. Morfologi, ukuran dan kadar limpahan EV diperinci menggunakan beberapa kaedah seperti pemblotan western, ELISA dan mikroskopi elektron mengikut saranan International Society of Extracellular Vesicles (ISEV). EV telah diasingkan daripada 20 sampel serum pesakit kanser usus yang menjalani rawatan kemoterapi berasaskan oxaliplatin juga daripada 22 sampel serum pesakit kanser usus yang tidak menjalani sebarang terapi (EV pra kemoterapi). Kesan fungsian EV disiasat secara in vitro menggunakan asai ko-kultur antara EV dan sel T CD8+ serta sel Jurkat. Selain itu, kami juga telah memprofilkan sitokin yang dirembeskan serta menentukan pengekspresan gen - gen berkaitan tindak balas imun. Kajian ini mendedahkan bahawa ukuran dan kadar limpahan EV adalah sedikit berbeza pasca-kemoterapi berbanding pra-kemoterapi tetapi mempunyai morfologi yang sama. Tambahan pula, sel T CD8+ dan sel Jurkat yang dikultur bersama EV pasca-kemoterapi tergencat dalam fasa S langsung mengakibatkan penurunan peratusan sel yang memasuki fasa G2/M. Kadar apoptosis sel T CD8+ dan sel Jurkat juga meningkat disebabkan oleh EV pasca-kemoterapi berbanding dikultur bersama EV yang tidak diaruh kemoterapi. Selain itu, gen – gen utama berkaitan dengan sitokin dan kematian sel imun seperti IL-2, sFasL dan Granzyme B diekspresikan lebih tinggi dalam sel T yang telah dikultur bersama EV diaruh kemoterapi. Profil sitokin yang dilepaskan oleh sel – sel imun setelah rangsangan oleh EV pra- dan pasca-kemoterapi juga diekspresikan berbeza - beza seperti IFN-ƴ dan IL-17. Secara keseluruhannya, hasil kajian ini menunjukkan bahawa EV yang telah diaruh kemoterapi mampu memberi kesan terhadap fungsi sel limfosit berbanding EV yang tidak diaruh kemoterapi.

Kajian fungsi gen yang berkaitan dengan kanser kolorektal di dalam titisan sel kemosensitisif berikutan penyenyapan gen daya pemprosesan tinggi

2016-07-15T00:00:00Z

Title: Kajian fungsi gen yang berkaitan dengan kanser kolorektal di dalam titisan sel kemosensitisif berikutan penyenyapan gen daya pemprosesan tinggi Authors: Tammy Ting Lik Tun Abstract: Perkembangan teknologi gangguan RNA (RNAi) membolehkan kajian ke atas fungsi sasaran molekul tertentu dilakukan. Penggunaan RNAi bersama 5-fluorourasil (5-FU) mampu mengurangkan dos agen anti-kanser yang diperlukan. Integrasi di antara data mikroatur umum (Oncomine) dengan set data hasil kajian mikroatur terkini telah menghasilkan sebanyak 20 gen beregulasi menaik yang terlibat di dalam fungsi proliferasi dan kitaran sel. Kajian ini dijalankan untuk mengkaji peranan biologi gen gen tersebut berikutan penyenyapan gen dan rawatan 5-FU dalam titisan sel kanser kolorektal, HCT116 dan HT-29. Titisan sel dirawat dengan dos 5-FU yang berbeza bermula dengan 0 µM sehingga 200 µM selama 24, 48 dan 72 jam. Kesan sitotoksik 5-FU ditentukan dengan nilai perencatan kepekatan separa (IC50). Titisan sel kemudiannya dirawat dengan RNA gangguan kecil (siRNA) dan dieram dengan 5-FU, iaitu 1/10 daripada kepekatan IC50, untuk analisis fungsi yang selanjutnya. Keberkesanan penyenyapan gen ditentukan dengan menggunakan kaedah kuantitatif tindak balas rantaian polimerase transkripsi berbalik (qPCR) selepas 48 jam tempoh transfeksi. Pengekspresan protein dikesan dengan menggunakan blot Western selepas 72 jam tempoh transfeksi. Kesan penyenyapan gen terhadap pembahagian sel ditentukan dengan menggunakan asai viabiliti sel pendarcahaya CellTiter-Glo®. Kesan sel yang ditransfeksi dengan siRNA terhadap apoptosis ditentukan dengan menggunakan asai aktiviti Caspase 3. Kesan sel yang ditransfeksi dengan siRNA terhadap migrasi dan invasi masing-masing ditentukan dengan menggunakan asai migrasi sel QCM chemotaxis dan asai invasi sel QCM collagen. Penyenyapan gen transmembrane protein 97 (TMEM97), dyskerin (DKC1), sterile alpha motif (SAM) and leucine zipper (LZ) containing kinase AZK (ZAK), CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 (CKS2) dan non-metastatic cells I (NME1) menurunkan pengekspresan mRNA secara signifikan selepas 48 jam transfeksi siRNA dalam kedua-dua titisan sel. Walau bagaimanapun, hanya 4 gen, iaitu TMEM97, DKC1, ZAK dan NME1, yang menunjukkan perencatan viabiliti sel secara signifikan (P < 0.05) berbanding dengan sel kawalan pada kedua-dua titisan sel. RNAi yang mensasarkan DKC1 menahan fasa G1 dalam kitaran sel HCT116. Penindasan DKC1 mengurangkan viabiliti sel dan menahan kitaran sel kerana gen tersebut terlibat dalam biosintesis protein yang diperlukan untuk pembahagian dan viabiliti sel. Apabila digabungkan dengan rawatan 5-FU, penyenyapan DKC1 meningkatkan kemosensitiviti sel HCT116 dengan mengurangkan lagi viabiliti sel dan menyekat sel pada fasa S kitaran sel. Pengurangan signifikan migrasi sel HCT116 juga diperhatikan dalam RNAi yang mensasarkan DKC1 dan NME1. Penyenyapan NME1 meningkatkan invasi sel HT-29 berbanding dengan sel kawalan (P < 0.05). Penindasan ekspresi NME1 dapat meningkatkan invasi sel kerana NME1 merupakan gen penindas metastasis yang menyekat invasi dan metastasis sel tumor. Kesimpulannya, penurunan ekspresi DKC1 menggunakan RNAi meningkatkan aktiviti anti-tumor dan kesan kemosensitiviti kanser manusia. Penyenyapan DKC1 dengan kombinasi rawatan kemoterapi merupakan strategi yang berpotensi untuk menyekat pertumbuhan kanser kolorektal.

Secretome mapping of the human gut and microbiome from colorectal cancer patients

2019-06-24T00:00:00Z

Title: Secretome mapping of the human gut and microbiome from colorectal cancer patients Authors: Putri Intan Hafizah Megat Mohd Azlan Abstract: In Malaysia, colorectal cancer (CRC) was the second most common cancer among men and women. The human gut is home to trillions of gut flora that thrive in delicate balance, which has helped maintain host’s gut homeostasis and mutually benefited both parties tremendously. However, a drastic perturbation of microbial composition has hampered gut homeostasis initiating tumour microenvironment for development of CRC. Hitherto, the study of human gut secretome is still scarce with gap of knowledge to be filled. The objective of this study was to profile secreted proteins released from the human gut and microbial of CRC patients and control with healthy colon morphology by assessing the secretome in stool samples, using mass spectrometry technology. Stool samples from 26 CRC and 20 controls were collected, homogenized and filtered prior to protein extraction and analysis. Samples were subjected for in solution digestion, followed by protein identification and quantification. Bioinformatics tools such as SPSS, MaxQuant, DAVID and String were used for statistical analysis, data visualization, functional annotations and prediction of protein interactions and pathways. We identified more human origin proteins in CRC as compared to control and inversely for proteins from microbial origin. The identified human proteins that are exclusive for CRC were mostly related to cell adhesion, intracellular signal transduction and angiogenesis functions and the top identified proteins were mapped to Stage I and II of CRC. The best prediction model for CRC was built upon the combination of human Huntingtin and RNA exonuclease 5 proteins. The model was sensitive but not specific in discriminating the control from CRC. Meanwhile, the top annotated KEGG pathway for human CRC-exclusive proteins was Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). In addition, yeast proteins were topping the microbial CRC-exclusive proteins list, with the predicted protein interactions mapped to DNA repair, transcription regulation and ATP binding. In conclusion, gut flora and human colon released abundance of microbial proteins to the external environment possibly mediating various host-microbe reactions and responses in CRC.

Validation of PASD1 protein as an immunotherapeutic target in colorectal cancer

2019-09-06T00:00:00Z

Title: Validation of PASD1 protein as an immunotherapeutic target in colorectal cancer Authors: Joanne Soh Ern Chi Abstract: Colorectal cancer (CRC) is the third commonest malignancy in Asia including Malaysia. Cancer testis antigens (CTA) which are expressed in a variety of cancers but with limited expression in normal tissues except the testis, represent an attractive approach to improve treatment options for CRC. PAS (Per ARNT Sim) domain containing 1 (PASD1) is a CTA reported to be expressed mostly in hematopoietic malignancies but has a limited expression in solid tumours. The aim of the study was to investigate the expression of PASD1 in CRC samples and assess the CD8 T cell responses, as well as the cytokine profiles upon induction with PASD1 peptides. PASD1 mRNA expression was determined via RT-PCR on paired tumour and normal tissue samples from 25 CRC patients. Tissue expression of PASD1 was assessed via immunohistochemistry in 23 CRC samples. Four immunogenic PASD1 peptides specific to HLA-A*24:02 were identified using web-based algorithms. Peripheral blood mononuclear cells from CRC patients were used to investigate the immunogenicity of these peptides in vitro using IFN-y ELISpot assay. The effects of the CD8+ T cells pulsed with PASD1 peptides against cancer cells were performed using the cytolytic and granzyme-B ELISpot cytotoxicity assays. The cytokine profiles of the co-culture between effector and target cells were also assessed. From this study, the gene and protein expression of PASD1 were detected in 20% and 17.3% of the CRC samples respectively. PASD1(4), was shown to be selectively immunogenic in CRC samples. The generated PASD1 specific cytotoxic T cells from the three CRC patients were able to lyse the SW480 cell line. Moreover, this study also demonstrated the dose-dependent increase of IL-10, IFN-y, TNF-α, sFas, sFasL, granzyme A, granzyme B and perforin in the co-culture media of CD8 T cells with SW480 cell line. Overall, the PASD1 (4) peptide with the amino acids sequence of TYCSSTVFL at the position 276-273 was identified to be relatively more immunogenic as compared to the other peptides and it represents a potential target for peptide-based immunotherapy in HLA-A*24:02 CRC.