Penentuan metilasi DNA pada promoter matrix metalloproteinase 1 (MMP1) dan MMP9 dalam kelahiran bayi pramatang

Abstract

Kelahiran bayi pramatang mencatat 6 ke 10 peratus daripada jumlah keseluruhan kelahiran bayi di negara Barat dan menyumbang lebih dua pertiga kematian perinatal. Pemahaman mengenai metilasi DNA boleh menyumbang kepada asas pengetahuan dalam memahami patogenesis kelahiran bayi pramatang. Objektif kajian ini adalah untuk menentukan kehadiran metilasi DNA pada promoter matrix metalloproteinase 1 (MMPI) dan matrix metalloproteinase 9 (MMP9) dalam kelahiran bayi matang dan bayi pramatang menggunakan analisis bisulfit, metilasi spesifik tindak balas berantai polimerase (MSP). Sampel darah vena ibu yang diperolehi daripada kelahiran bayi matang (n = 15) dan bayi pramatang (n = 15) melalui rawatan bisulfit dan menjalani proses MSP. Kaedah MSP dijalankan menggunakan kitaran parameter yang merangkumi langkah pengaktifan awal pada suhu 95°C, penyahaslian pada suhu 94°C diikuti oleh langkah penyepuhan. Terdapat 4 suhu penyepuhan; 56.1°C untuk methylated MMP1, 53.7°C untuk unmethylated MMP1, 51.9°C untuk methylated MMP9 dan 52.3°C untuk unmethylated MMP9. Langkah terakhir ialah langkah pemanjangan pada suhu 72°C. Keputusan MSP disahkan menggunakan kaedah penjujukan DNA. Penilaian keputusan penjujukan DNA bagi analisis gugusan CpG dibuat menggunakan perisian ClustalW dan SPSS. Primer bagi MMP1 terletak di antara -1226 ke -1378 daripada lokasi permulaan transkripsi (transcription start site) (TSS) gen MMPI yang mengandungi lima gugusan CpG. Sementara itu, primer MMP9 pula terletak di antara -337 ke -447 daripada lokasi TSS gen MMP9 dan mengandungi enam gugusan CpG. Metilasi MMP1 dikesan pada 30 sampel kelahiran matang dan pramatang menggunakan MSP. Bagi promoter MMP9 pula, kesemua sampel mempunyai turutan DNA metilasi dan tidak metilasi. Keputusan gen MMP1 disahkan dengan kaedah penjujukan DNA. Tetapi keputusan validasi untuk gen MMP9 adalah gagal. Analisis gugusan CpG bagi MMP1 menunjukkan kumpulan kelahiran bayi matang mempunyai gugusan CpG metilasi yang lebih tinggi iaitu 49 (65.33%) berbanding kumpulan kelahiran bayi pramatang yang hanya mempunyai 39 (52%) daripada jumlah keseluruhan 75 CpG (t=0.694, p<0.05). Metilasi dikesan pada 4 daripada 5 gugusan CpG dalam promoter MMPI di mana ia melibatkan 7 sampel kelahiran matang (46.47%) dan hanya 2 sampel pramatang (13.33%). Peratusan methylated MMP1 yang lebih tinggi berpotensi menyebabkan ekspresi MMP1 berkurangan dan dengan itu mengekalkan kekuatan kolagen fibrilar pada membran amnion. Ini dapat mengekalkan kehamilan sehingga matang. Kesimpulannya, kelahiran bayi pramatang mempunyai peratusan gugusan CpG metilasi yang lebih rendah berbanding kelahiran bayi matang bagi gen MMPI yang menggunakan primer antara -1226 ke -1378 daripada TSS gen MMP1.