Pembangunan kaedah gangguan RNA (RNAi) untuk penyenyapan gen dan pencirian protein reseptor membran Ganoderma boninense

Abstract

Kelapa sawit merupakan tanaman komoditi yang penting dan merupakan antara penyumbang terbesar kepada ekonomi Malaysia. Namun begitu, pokok kelapa sawit terdedah kepada pelbagai penyakit terutamanya penyakit reput pangkal batang yang disebabkan oleh kulat Ganoderma boninense. Antara masalah utama untuk menangani jangkitan kulat ini dengan berkesan adalah kekurangan maklumat tentang jangkitan kulat ini pada peringkat molekul. Oleh itu pembangunan kaedah untuk menganalisis kefungsian gen serta pengenalpastian gen terlibat dalam kepatogenan G. boninense adalah diperlukan. Justeru, objektif kajian ini adalah untuk membangunkan kaedah penyenyapan gen menggunakan strategi gangguan RNA (RNA interference, RNAi) serta mengenal pasti dan menciri protein reseptor membran yang diramal terlibat dalam kepatogenan kulat. Bagi membangunkan kaedah RNAi, perlombongan data genom G. boninense dilakukan untuk mengenal pasti protein utama yang diperlukan untuk RNAi berfungsi. Untuk membuktikan RNAi sesuai digunakan untuk penyenyapan gen G. boninense, gen pyrG yang mengekod orotidin-5'-monofosfat dekarbosilase, enzim utama dalam biosintesis urasil, telah dipilih sebagai gen sasaran. Bagi menciri protein reseptor membran yang diramal berdasarkan struktur homologi terlibat dalam kepatogenan, gen mengekod reseptor terikat protein G (GPCR) G. boninense telah dipencil dan dicirikan. Sebanyak tiga gen sasaran telah disenyapkan menggunakan kaedah RNAi dan analisis kepatogenan terhadap dua gen sasaran daripada GPCR Kelas III melalui Indeks Keterukan Penyakit (DKI) telah dijalankan. Perlombongan data genom dan analisis in silico terhadap komponen RNAi telah mengenal pasti kehadiran protein Dicer, Argonaut dan RdRp di dalam G. boninense PER71. Penyenyapan gen pyrG dengan RNAi telah menghasilkan strain mutan yang tidak dapat tumbuh dengan baik berbanding jenis liar di atas agar tanpa urasil. Pengekspresan gen pyrG juga berkurangan sehingga 73% berbanding strain liar dan ini menunjukkan teknik RNAi berpotensi untuk digunakan bagi penyenyapan gen G. boninense. Seterusnya, melalui analisis in silico, kehadiran protein daripada lima kelas GPCR di dalam genom G. boninense PER71 iaitu Kelas II (reseptor feromon), Kelas III (reseptor gula), Kelas IV (reseptor nitrogen), Kelas VIII (hemolisin) dan Kelas IX (protein seperti opsin) telah dikenal pasti. Penyenyapan gen menggunakan RNAi terhadap dua gen daripada kelas III iaitu git3-1 dan git3-2 menghasilkan mutan yang menunjukkan pengurangan pengekspresan bagi kedua-dua gen. DKI yang dilakukan terhadap anak pokok yang dijangkiti strain mutan [git3-1] i dan [git3-2] i menunjukkan pengurangan penyakit terutamanya di peringkat awal jangkitan berbanding strain liar. Kesimpulannya, hasil kajian ini menunjukkan bahawa kaedah penyenyapan RNAi sesuai digunakan untuk analisis kefungsian gen kulat G. boninense manakala pencirian dua protein reseptor daripada kelas III GPCR menunjukkan kedua-dua protein tersebut mungkin terlibat dalam kepatogenan kulat ini pada peringkat awal jangkitan.