Pengenalpastian transkrip sasaran melalui analisis penjujukan degradom dalam ketum (Mitragyna speciosa)

Abstract

Mitragyna speciosa terkenal dengan kesan opioid yang disebabkan oleh bioaktif seperti mitraginin (MG). Walaupun kesan MG dan ekstrak daun M. speciosa telah dikaji secara meluas pada manusia dan haiwan tetapi maklumat mengenai biosintesis MG dan pengawal aturan tapak jalan biosintesisnya di dalam daun M. speciosa masih belum dikaji dengan mendalam. Salah satu komponen utama dalam pengawalaturan pengekspresan gen tumbuhan adalah melalui tindakan mikroRNA (miRNA) yang menyekat pengekspresan gen sama ada melalui pemotongan transkrip atau melalui perencatan translasi transkrip. Transkrip sasaran ini melibatkan gen yang mengekodkan protein pengawal atur atau protein yang terlibat langsung dalam tapak jalan biosintesis metabolit sekunder. Kajian terdahulu telah berjaya mengenal pasti beberapa miRNA dalam M. speciosa yang dipercayai terlibat dalam mengawal atur penghasilan mitraginin dan sebatian-sebatian alkaloid lain. Namun begitu, penemuan tersebut perlu disahkan melalui pengenalpastian keseluruhan transkrip yang dipotong melalui pendekatan analisis penjujukan degradom. Analisis penjujukan degradom adalah pendekatan yang digunakan bagi mendapatkan liputan yang terbaik dalam pengenalpastian keseluruhan transkrip yang disasarkan oleh miRNA. Dalam kajian ini, daun M. speciosa telah diperlakukan dengan semburan prakursor triptofan berkepekatan 100 mg/L dan dibiarkan selama 48 jam bagi mendapatkan populasi daun yang menghasilkan mitraginin secara terbeza. Sebanyak enam perpustakaan degradom telah dihasilkan dari tiga sampel daun terawat dan tiga daun kawalan. Hasil kajian menunjukkan bahawa daun M. speciosa yang dirawat dengan semburan triptofan mempunyai kadar MG 1.77 kali ganda lebih tinggi berbanding daun kawalan. Analisis penjujukan degradom terhadap 102 288 transkrip menunjukkan bahawa 13 240 transkrip disasarkan oleh 1828 miRNA, yang dikelaskan kepada 134 famili, termasuk 17 miRNA novel yang menyasarkan 223 transkrip. Sebanyak 678 transkrip sasaran yang mempunyai tapak pemotongan yang signifikan, dengan 41 transkrip sasaran disasarkan oleh 31 miRNA yang dieskpreskan secara terbeza (DEmiRNA). Beberapa gen sasaran yang terlibat dalam biosintesis MG telah dikenalpasti, termasuk STR1, SSL2, SS1, dan SSL10 yang mengekodkan enzim Striktosidina sintase (STR). Selain itu, terdapat juga gen sasaran yang mengekodkan enzim O-metiltransferase (OMT) seperti COMT, IMT1, CS3, 7OMT, dan ROMT. Manakala, enzim Demetildihidrokorinantein/demetilkorinanteidin sintase (DCS) dikodkan oleh gen sasaran seperti ADHL7, ADH2, dan IMT1. Analisis RT-qPCR mendapati empat pasangan miRNA-transkrip sasaran menunjukkan perubahan pengekspresan yang berlawanan iaitu cca-miR396c-SS1, lus-miR171h-EO, vvi-miR398c-GRXC9, dan sbi miR160c-ARF18. Hasil kajian ini menyediakan maklumat baru bagi keseluruhan transkrip sasaran miRNA yang terlibat dalam rangkaian pengawalaturan gen dalam M. speciosa. Dapatan ini amat berguna dalam memahami mekanisme pengawalaturan biosintesis metabolit sekunder dan boleh digunakan sebagai sumber rujukan dalam kajian untuk memanipulasi penghasilan metabolit sekunder yang berguna dalam sel tumbuhan terutamanya dalam M. speciosa