Pembangunan dan pengesahan aptamer DNA sebagai anti-pengesanan kuorum terhadap spesies vibrio mengunakan analisis perbandingan transkriptom

Abstract

Bakteria di bawah genus Vibrio dan klad harveyi adalah agen penyebab untuk vibriosis dan Penyakit Nekrosis Hepatopankreas Akut di dalam udang yang mengakibatkan kerugian pengeluaran yang besar. Penyakit ini berlaku disebabkan oleh toksin baru yang diperoleh iaitu PirA dan PirB yang mengakibatkan hampir 100 % kadar kematian di semua ladang udang yang dijangkiti. Kebanyakan pengekspresan faktor virulen termasuk gen toksin baru yang diperoleh dalam spesies Vibrio didapati dikawal oleh pengesanan kuorum, satu mekanisme yang membenarkan bakteria menyelaraskan pengekspresan gen dengan pengesanan isyarat kimia yang dipanggil pengaruh auto. Dalam kajian ini, aptamer DNA (VPQ1) yang mengikat protein LuxP rekombinan tulen telah diperkembangkan dan diasingkan untuk mengganggu dan menghalang laluan lata isyarat pengesanan kuorum. Kesan rawatan aptamer VPQ1 telah disahkan menggunakan analisis perbandingan transkriptom di mana kultur spesies Vibrio dirawat dengan 10 μM VPQ1 dan 100 μM VPQ1 selama tiga jam, dengan PBST sebagai kawalan negatif dan 10 μM furanon terbrominasi sebagai kawalan positif. Protein LuxP rekombinan dengan tag-His ditulenkan dalam kepekatan yang tinggi iaitu 0.1-0.8 mg/mL dan dieram dengan pustaka DNA bebenang tunggal dengan ketegasan yang meningkat. Kumpulan aptamer DNA yang berpotensi diasingkan, dijujukkan, dan sebanyak 1 114 jujukan aptamer terhasil. Aptamer VPQ1 dan VPQ2 dengan kelimpahan tertinggi telah dipilih untuk pengesahan pengikatan. Pemalar pemisahan direkodkan masing-masing sebanyak 23.3 nanomolar dan 24.2 nanomolar. Sejumlah 793, 2358, dan 2935 gen yang diekspres secara berbeza pada Padj <0.05 dalam sampel masing-masing yang dirawat dengan 10 μM VPQ1, 100 μM VPQ1 dan kawalan positif. Analisis pengayaan dengan nilai q<0.05 mendedahkan 8 tapak jalan KEGG telah diperkaya dalam kedua-dua sampel yang dirawat dengan 10 μM VPQ1 dan kawalan positif manakala 11 tapak jalan KEGG telah diperkaya dalam sampel yang dirawat dengan 100 μM VPQ1. Kesemua tapak jalan KEGG yang diperkaya melibatkan metabolisme bakteria. Oleh itu, gen yang diekspres secara berbeza dan signfikan di dalam tapak jalan tambahan seperti pengesanan kuorum, pembentukan flagelum, dan pembentukan biofilem dianalisis dengan lebih lanjut. Kesimpulannya, penemuan gen yang dikawal atur menurun yang terlibat dalam tapak jalan tambahan menunjukkan rawatan aptamer VPQ1 berkesan dalam menganggu kepatogenan spesies Vibrio.