Kestabilan kromosom dan pengekspresan gen sel stem embrionik manusia mel-1 dengan pengkulturan jangka panjang menggunakan sistem bebas sel pembekal autogenik daripada sel progenitor mesenkimanya

Abstract

Sel stem embrionik manusia (hESC) merupakan sel pluripoten yang boleh memperbaharui diri justeru ia berpotensi tinggi dalam aplikasi perubatan regeneratif. Kekurangan substrat xeno-free extrasel (ECM) yang selamat digunakan menghadkan penggunaan derivatif sel hESC dalam aplikasi terapi penggantian sel. Keadaan kultur termasuk penggunaan medium dan substrat kultur yang suboptima merupakan faktor utama yang menyumbang kepada ketidakstabilan kromosom sel hESC. Kajian ini bertujuan untuk mengkaji kestabilan kromosom sel hESC dan menentukan ekspresi gen sel hESC dan sel induk mesenkima (MPC) semasa pengkulturan di atas ECM dalam jangka masa panjang. Kajian ini telah menggunakan titisan sel hESC (MEL-1). Sel MEL-1 dikultur atas ECM yang dipencilkan daripada sel MPC (autogenik) yang terhasil daripada sel hESC melalui protokol pembezaan yang novel yang dihasilkan dalam kajian ini. Pencirian sel MPC dan hESC telah dilakukan menggunakan teknik pewarnaan imunositokimia dan analisis aliran sitometri terhadap panel penanda sel stem mesenkima dan penanda pluripoten sel masing-masing. Asal usul sel MPC telah ditentukan dengan menjalankan analisis RT-PCR terhadap gen yang spesifik pada lapisan germa yang berlainan. Pencirian bagi fungsi sel hESC telah dilakukan dengan menggunakan asai pembentukan badan embriod. Analisis pengekspresan gen yang mengawalatur pluripotensi dan lanjut usia (longevity) sel telah dilakukan dengan RT-PCR manakala status penuaan (senescence) sel hESC dan MPC juga telah ditentukan melalui asai penuaan galaktosidase. Analisis kromosom sel hESC telah dilakukan dengan teknik kariotip piawai. Analisis pewarnaan imunositokimia dan aliran sitometri terhadap sel MPC menunjukkan ekspresi penanda-penanda awal sel mesenkima. Analisis spektrometer jisim bertandem terhadap campuran ECM yang terhasil daripada MPC menunjukkan kehadiran komponen protein extrasel seperti tenascin C, fibronektin, dan vitronektin. Kami menunjukkan sel hESC yang dikultur atas ECM kekal pluripotensinya selama 61 laluan dengan mengekpres protein penanda pluripotensi (SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-81, TRA-1-60, Oct-4) dan juga gen yang terlibat dalam pengawalaturan pluripotensi sel seperti FoxD3, Oct-4, Tdgfl, Sox- 2, Nanog dan Rex1. Sel hESC tersebut didapati mempunyai kebolehan untuk membeza kepada sel mewakili lapisan ektoderma, endoderma, dan mesoderma. Sel hESC tersebut juga didapati mengekalkan ekspresi gen lanjut usia hTERT dan menunjukkan hasil pewarnaan yang negatif terhadap asai penuaan B-galaktosidase di samping menunjukkan kariotip yang normal (46-XY). Kesimpulannya, sel MEL-1 yang dikultur pada ECM tersebut telah menunjukkan kariotip yang normal dan ekspresi gen lanjut usia yang stabil. Sistem pengkulturan xenofree yang autogenik dan bebas daripada sel pembekal ini telah menyokong pengembangan sel hESC MEL-1 dengan stabil dan berpotensi dimajukan untuk aplikasi klinikal.