Kesan suhu tinggi terhadap kandungan mitraginin dan gen terekspres secara berbeza dalam daun Mitragyna speciosa

Abstract

Mitragyna speciosa atau ketum merupakan sejenis pokok ubatan tropika yang berasal dari Asia Tenggara dalam famili kopi, Rubiaceae. Ia telah digunakan sebagai penawar kepada batuk, cirit-birit, demam dan mengurangkan kesakitan. Ia turut mempunyai banyak sifat perubatan, antaranya ialah kesan menyerupai opioid, analgesik dan antitusif. Dua daripada sebatian aktif secara farmakologi yang dijumpai pada ketum adalah mitraginin (MG) dan 7-hidroksimitraginin (7-OH). Kedua-dua kompaun tersebut dilaporkan mempunyai aktiviti menyerupai opioid, dengan 7-OH mempunyai aktiviti yang lebih kuat. Tumbuhan mempunyai metabolisme primer dan sekunder. Metabolisme primer menghasilkan metabolit yang diperlukan untuk tumbesaran dan perkembangan tumbuhan manakala metabolisme sekunder pula menghasilkan kompaun yang terlibat dalam sistem pertahanan tumbuhan terhadap pelbagai tekanan biotik dan abiotik. Faktor persekitaran seperti suhu, kemarau, peningkatan karbon dioksida dan kemasinan mempengaruhi tumbesaran dan penghasilan metabolit sekunder tumbuhan. Kajian lepas menunjukkan bahawa peningkatan suhu meningkatkan penghasilan metabolit sekunder tumbuhan. Sebelum ini, tapak jalan biosintesis MG telah dilaporkan tetapi pengawalaturan molekul dan laluan hiliran biosintesis MG masih tidak lengkap. Oleh itu, penyelidikan ini bertujuan untuk merungkai pengawalaturan biosintesis MG berdasarkan analisis transkriptom hasil tindak balas terhadap suhu tinggi. Klon M. speciosa telah berjaya dibiakkan melalui keratan batang dan ditanam di nurseri. Perlakuan suhu tinggi telah dikendalikan di dalam kebuk tumbesaran dengan kondisi yang terkawal. Analisis fitokimia terhadap sampel daun selepas perlakuan suhu tinggi menunjukkan peningkatan kandungan MG. Penjujukan RNA telah dijalankan menggunakan platform Illumina. Jujukan tersebut telah dihimpunkan menggunakan genom rujukan yang menjana 72,885 transkrip dengan 70,406 gen yang telah diketahui dan 2,479 transkrip novel. Analisis komparatif untuk sampel kawalan dan perlakuan telah mengenal pasti 16,003 gen terekspres secara berbeza (DEG), di mana 6,894 gen dikawal atur menaik dan 9,109 gen dikawal atur menurun. Anotasi kefungsian gen yang telah diketahui dan transkrip novel telah dianotasi menggunakan pangkalan data daripada Swiss-Prot, Pfam, GO, KO dan KEGG. Anotasi paling tinggi bagi GO adalah pada lipatan protein, proses metabolik trehalosa, fotosintesis, fotosistem, tilakoid, aktiviti pengawalaturan ATPase, aktiviti ribonuklease hibrid RNA-DNA dan aktiviti oksidoreduktase. Anotasi paling signifikan dalam KEGG ialah tapak jalan bagi fotosintesis, metabolisme karbon, tapak jalan pentosa fosfat dan metabolisme kanji dan sukrosa. Keluarga faktor transkripsi paling tinggi yang telah dikenal pasti daripada DEG ialah bHLH, MYB, WRKY, ERF, bZIP, C2H2 dan NAC. Sebanyak empat gen yang terlibat dalam tapak jalan biosintesis MG telah disahkan melalui tindak balas polimerase berantai kuantitatif transkripsi berbalik (RT-qPCR) dengan gen Acetylajmalan esterase dikawal atur menaik manakala gen Deacetoxyvindoline 4-hydroxylase, Isopentenyldiphosphate Delta-isomerase II, dan Tabersonine 16-hydroxylase dikawal atur menurun. Objektif kajian ini telah dicapai dengan pengkuantitian kandungan MG sewaktu perlakuan suhu tinggi, pengenalpastian DEG terlibat dalam biosintesis MG dan pengesahsahihkan pengekspresan gen tersebut melalui RT-qPCR. Pencapaian objektif tersebut menjadi asas penyelidikan masa depan bagi menjelaskan tapak jalan tindak balas tekanan suhu tinggi dan fisiologi tumbuhan sewaktu perubahan iklim.