Kejuruteraan biologi mikrob penghasil polihidroksialkanoat untuk biopenukaran furfural dan substrat polietilena tereftalat

Abstract

Bakteria penghasil polihidroksialkanoat (PHA) merupakan casis biologi sintetik mikrob yang semakin mendapat perhatian bagi penghasilan bioproduk berasaskan kitaran plastik bioekonomi. Bakteria penghasil PHA seperti Cupriavidus necator dan Pseudomonas sp. yang telah banyak dikaji bagi pembangunan dan penghasilan bioproduk melalui teknologi fermentasi. Namun begitu, strain jenis liar mikrob ini agak terhad dari segi keupayaan menggunakan sumber nutrien dari sisa biojisim dan juga sumber baharu seperti, sisa plastik. Berbanding dengan mikrob model lain seperti Escherichia coli dan Saccharomyces cerevisiae, penggunaan bakteria penghasil PHA ini masih terhad kerana kekangan set alatan genetik untuk pembangunan strain terjurutera biologi secara efisien, boleh diprogram dan bermodul. Oleh itu, kajian ini memfokuskan untuk pembangunan set alatan genetik untuk meningkatkan keupayaan mengubahsuai strain penghasil PHA menggunakan kaedah biologi sintetik dan kejuruteraan biologi. Tiga bakteria penghasil PHA telah dipilih iaitu Cupriavidus necator, Pseudomonas putida dan Pseudomonas extremaustralis sebagai casis biologi sintetik dan biokatalitik sel penuh. Ke arah meningkatkan keupayaan mikrob untuk menggunakan sisa hidrolisat kelapa sawit, kajian ini memilih untuk mengekspreskan enzim furfural reduktase di dalam P. extremaustralis bagi penukaran dan penyahtoksikan sebatian furfural yang toksik kepada sel. Untuk pembangunan casis bagi kitar semula biologi plastik, P. putida dan C. necator telah direka bentuk untuk mengekspres polietilena tereftalat (PET) hidrolase yang menukarkan plastik PET kepada monomer boleh guna. Untuk tujuan ini, gen furfural reduktase FucO dari Escherichia coli dan PET hidrolase PETase dari Ideonella sakaiensis telah dipilih untuk pengklonan dan pengekspresan di dalam casis penghasil PHA tereka bentuk secara biologi. Sel kompeten P. extremaustralis, P. putida dan C. necator digunakan untuk transformasi plasmid konstruk yang mengekspreskan FucO dan PETase menggunakan vektor pengekspresan tereka bentuk. Untuk penghasilan enzim PETase secara ortogon, beberapa jenis plasmid pSVOP telah dibina iaitu pSVOP-INP-PETase-CBM, pSVOPINP-PETase dan pSVOP-ss-PETase telah ditransformasi ke dalam strain P. putida dan C. necator. Strain terjurutera pFucO P. extremaustralis menunjukkan aktiviti furfural reduktase yang tinggi sebanyak 15.6 U/mg, 18.8 kali lebih tinggi daripada strain kawalan pJM105 (0.83 U/mg). Apabila diuji dengan 10 mM furfural, strain pFucO ini menunjukkan pertumbuhan yang tinggi berbanding strain kawalan yang terbantut kesan daripada kepekatan fufural di dalam kaldu LB. Bagi casis C. necator, strain pSVOP-ssPETase menghasilkan aktiviti PETase tertinggi dengan nilai OD405 = 0.46 berbanding dengan konstruk strain pSVOP-INP-PETase (OD405 = 0.37), strain pSVOP-INPPETase-CBM (OD405 = 0.4), dan strain pSVOP (OD405 = 0.15). Di dalam casis P. putida, strain pSVOP-ss-PETase juga menghasilkan aktiviti PETase tertinggi dengan nilai (OD405 = 0.67) berbanding dengan konstruk strain pSVOP-INP-PETase (OD405 = 0.45), strain pSVOP-INP-PETase-CBM (OD405 = 0.51), dan strain pSVOP (OD405 = 0.26). Keputusan yang diperoleh membuktikan keberhasilan dalam membangunkan strain terujutera P. extremaustralis, P. putida dan C. necator casis biologi sintetik bagi meningkatkan pengekspresan dan biokatalisis menggunakan pelantar kejuruteraan mikrob.