Kajian fungsi gen yang berkaitan dengan kanser kolorektal di dalam titisan sel kemosensitisif berikutan penyenyapan gen daya pemprosesan tinggi

Abstract

Perkembangan teknologi gangguan RNA (RNAi) membolehkan kajian ke atas fungsi sasaran molekul tertentu dilakukan. Penggunaan RNAi bersama 5-fluorourasil (5-FU) mampu mengurangkan dos agen anti-kanser yang diperlukan. Integrasi di antara data mikroatur umum (Oncomine) dengan set data hasil kajian mikroatur terkini telah menghasilkan sebanyak 20 gen beregulasi menaik yang terlibat di dalam fungsi proliferasi dan kitaran sel. Kajian ini dijalankan untuk mengkaji peranan biologi gen gen tersebut berikutan penyenyapan gen dan rawatan 5-FU dalam titisan sel kanser kolorektal, HCT116 dan HT-29. Titisan sel dirawat dengan dos 5-FU yang berbeza bermula dengan 0 µM sehingga 200 µM selama 24, 48 dan 72 jam. Kesan sitotoksik 5-FU ditentukan dengan nilai perencatan kepekatan separa (IC50). Titisan sel kemudiannya dirawat dengan RNA gangguan kecil (siRNA) dan dieram dengan 5-FU, iaitu 1/10 daripada kepekatan IC50, untuk analisis fungsi yang selanjutnya. Keberkesanan penyenyapan gen ditentukan dengan menggunakan kaedah kuantitatif tindak balas rantaian polimerase transkripsi berbalik (qPCR) selepas 48 jam tempoh transfeksi. Pengekspresan protein dikesan dengan menggunakan blot Western selepas 72 jam tempoh transfeksi. Kesan penyenyapan gen terhadap pembahagian sel ditentukan dengan menggunakan asai viabiliti sel pendarcahaya CellTiter-Glo®. Kesan sel yang ditransfeksi dengan siRNA terhadap apoptosis ditentukan dengan menggunakan asai aktiviti Caspase 3. Kesan sel yang ditransfeksi dengan siRNA terhadap migrasi dan invasi masing-masing ditentukan dengan menggunakan asai migrasi sel QCM chemotaxis dan asai invasi sel QCM collagen. Penyenyapan gen transmembrane protein 97 (TMEM97), dyskerin (DKC1), sterile alpha motif (SAM) and leucine zipper (LZ) containing kinase AZK (ZAK), CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 (CKS2) dan non-metastatic cells I (NME1) menurunkan pengekspresan mRNA secara signifikan selepas 48 jam transfeksi siRNA dalam kedua-dua titisan sel. Walau bagaimanapun, hanya 4 gen, iaitu TMEM97, DKC1, ZAK dan NME1, yang menunjukkan perencatan viabiliti sel secara signifikan (P < 0.05) berbanding dengan sel kawalan pada kedua-dua titisan sel. RNAi yang mensasarkan DKC1 menahan fasa G1 dalam kitaran sel HCT116. Penindasan DKC1 mengurangkan viabiliti sel dan menahan kitaran sel kerana gen tersebut terlibat dalam biosintesis protein yang diperlukan untuk pembahagian dan viabiliti sel. Apabila digabungkan dengan rawatan 5-FU, penyenyapan DKC1 meningkatkan kemosensitiviti sel HCT116 dengan mengurangkan lagi viabiliti sel dan menyekat sel pada fasa S kitaran sel. Pengurangan signifikan migrasi sel HCT116 juga diperhatikan dalam RNAi yang mensasarkan DKC1 dan NME1. Penyenyapan NME1 meningkatkan invasi sel HT-29 berbanding dengan sel kawalan (P < 0.05). Penindasan ekspresi NME1 dapat meningkatkan invasi sel kerana NME1 merupakan gen penindas metastasis yang menyekat invasi dan metastasis sel tumor. Kesimpulannya, penurunan ekspresi DKC1 menggunakan RNAi meningkatkan aktiviti anti-tumor dan kesan kemosensitiviti kanser manusia. Penyenyapan DKC1 dengan kombinasi rawatan kemoterapi merupakan strategi yang berpotensi untuk menyekat pertumbuhan kanser kolorektal.