Prevalens bakteria endosimbiotik Wolbachia dalam populasi nyamuk liar di Semenanjung Malaysia menggunakan amplifikasi isoterma berpengantara gelung (LAMP)

Abstract

Pendekatan baru menggunakan nyamuk Aedes dijangkiti Wolbachia dijangka dapat mengurangkan penyebaran virus denggi. Wolbachia ialah bakteria yang diwarisi secara maternal, mempunyai kebolehan untuk mengaruh ketidakserasian sitoplasmik (CI). CI yang diaruh membolehkan bakteria bermandiri dalam populasi nyamuk. Sebelum nyamuk dijangkiti Wolbachia ini dilepaskan, penyaringan status jangkitan Wolbachia secara semulajadi dalam populasi nyamuk liar perlu dilaksanakan. Disebabkan oleh bilangan sampel nyamuk yang banyak, LAMP dicadangkan sebagai satu teknik yang mudah dan menjimatkan masa serta tidak memerlukan peralatan berteknologi tinggi. Objektif utama kajian ini adalah untuk mengenalpasti prevalens Wolbachia dalam pelbagai spesies nyamuk liar di Semenanjung Malaysia menggunakan protokol LAMP yang baru dibangunkan dan dibanding dengan prevalens Wolbachia melalui kaedah PCR. Persampelan nyamuk dilakukan dengan menggunakan beberapa kaedah persampelan dan nyamuk dewasa yang diperoleh diidentifikasi spesiesnya. Kemudian, pengenalpastian Wolbachia dijalankan menggunakan kaedah PCR dan LAMP dengan menyasarkan gen Wolbachia 16S rDNA. Analisis hasil amplifikasi LAMP dilaksanakan melalui gel elektroforesis diikuti dengan pengesanan titik akhir menggunakan pewarna biru hidroksinaftol dan pencernaan oleh enzim penyekatan RsaI. Hasil amplifikasi PCR dicerna menggunakan RsaI untuk membezakan Wolbachia kepada superkumpulan A dan B. Hasil daripada kajian ini melaporkan nyamuk Aedes albopictus (74.72%) adalah spesies yang pradominan diperoleh, diikuti dengan Aedes aegypti (11.58%), Armigeres subalbatus (4.60%), Culex sitiens (1.74%), Culex quinquefasciatus (1.05%), Culex hutchinsoni (1.00%) dan Culex mimeticus (0.56%). Kajian ini turut melaporkan kehadiran Coquillettidia crassipes, Aedes (Edwardsaedes) imprimens dan Aedes (Paraedes) collessi, yang merupakan spesies yang jarang dilaporkan di Semenanjung Malaysia. Daripada 765 sampel nyamuk yang diuji, 349 (45.62%) adalah positif dengan LAMP, manakala 237 (30.98%) adalah positif dengan PCR. Terdapat hubungan yang signifikan antara bilangan sampel positif dengan Wolbachia melalui pengenalpastian menggunakan kaedah LAMP dan PCR (χ2= 61.31, df=1, N=765, p < 0.05) dengan nilai kappa (κ), 0.27 dan nilai Phi, 0.283. LAMP adalah kaedah yang lebih sensitif dan berkebolehan untuk mengesan infeksi Wolbachia yang rendah dalam individu nyamuk berbanding PCR. Pencernaan produk PCR menunjukkan 52.4% (99/189) daripada nyamuk positif Wolbachia adalah terinfeksi dengan kedua-dua superkumpulan manakala selebihnya terinfeksi secara tunggal dengan superkumpulan A dan B, masing-masing 27% (51/189) dan 20.6% (39/189). Walau bagaimanapun, pencernaan produk LAMP tidak boleh membezakan superkumpulan Wolbachia. Kesimpulannya, kajian ini mengetengahkan aplikasi Wolbachia-LAMP sebagai satu kaedah penyaringan molekular di lapangan serta membolehkan pengesanan Wolbachia pada infeksi rendah dengan penghasilan salinan DNA yang tinggi. Hasil kajian menunjukkan bahawa prevalens Wolbachia dan corak infeksi superkumpulan adalah berbeza bagi setiap lokaliti. Data taburan Wolbachia ini adalah penting bagi rujukan pihak berkuasa kesihatan dan membantu dalam perlaksanaan teknologi berasaskan Wolbachia sebagai salah satu strategi kawalan denggi secara biologi.