Analisis transkriptom dan metabolom pokok garuhan aruhan semula jadi dan buatan serta pencirian alfa-terpineol sintase rekombinan daripada Aquilaria malaccensis

Abstract

Aquilaria malaccensis merupakan tumbuhan yang penting daripada aspek ekonomi disebabkan oleh gaharu yang dihasilkannya memiliki nilai pasaran yang tinggi. Gaharu A. malaccensis kaya dengan derivatif kromon feniletil dan terpena termasuk monoterpena dan sesquiterpena yang dihasilkan dalam pokok yang tercedera sebagai tindak balas pertahanan pokok. Untuk memahami mekanisme penghasilan gaharu dalam A. malaccensis, kajian integrasi data profil metabolit dan transkriptom serta analisis protein rekombinan monoterpena sintase daripada tisu batang sihat, aruhan semula jadi dan aruhan buatan telah dilakukan. Sebanyak 99 metabolit telah dikenal pasti dalam ketiga-tiga sampel merangkumi pelbagai kumpulan metabolit primer dan sekunder dengan sesquiterpena sebagai kumpulan terbesar diikuti monoterpena. Daripada jumlah ini, 93 metabolit mempunyai perbezaan yang signifikan antara ketigatiga sampel yang dipercayai menyumbang kepada kualiti, warna dan aroma serta sistem pertahanan semasa pembentukan gaharu. Profil transkrip untuk tisu batang A. malaccensis sihat dan yang diaruh telah diperoleh. Sejumlah 85,986 unigen telah dijumpai dan sebanyak 46,755 transkrip dianotasi kepada gen yang diketahui daripada pangkalan data NR NCBI. Analisis pengekspresan gen yang berbeza (DEG) menunjukkan 1,911 unigen dikawal atur menaik dan 1,857 dikawal atur menurun dalam A. malaccensis yang menghasilkan gaharu. Analisis ontologi gen (GO) menunjukkan gen yang diekspreskan secara berbeza didapati terlibat dalam banyak proses sel termasuk proses metabolisme karbohidrat. Proses ini merangkumi aktiviti biosintesis terpena yang didapati dikawal atur menaik dengan ketara. Sebanyak 234 unigen didapati terlibat dalam tapak jalan biosintesis terpena. Pengekspresan berbeza bagi dua gen yang terlibat dalam tapak jalan biosintesis terpena iaitu alfa-terpineol sintase dan germakren D sintase telah disahkan menggunakan analisis PCR kuantitatif masa-nyata (RT-qPCR) yang menunjukkan bahawa pengekspresan kedua-dua gen ini dikawal atur menaik dalam tisu batang yang menghasilkan gaharu. Hasil integrasi omik iaitu transkriptomik dan metabolomik memberikan maklumat yang menyeluruh mengenai biosintesis gaharu dalam Aquilaria yang melibatkan tapak jalan terpena. Analisis bioinformatik yang dijalankan menunjukkan bahawa cDNA lengkap AmATS mengandungi rangka bacaan terbuka sepanjang 1,812 bp yang mengekodkan gen alfa terpineol sintase mengandungi 604 asid amino dengan berat molekul 69.28 kDa dan nilai pI 6.16. Protein rekombinan AmATS telah berjaya diekspreskan secara separa terlarut kerana ditemui dalam kedua-dua fraksi terlarut dan tak terlarut dalam sel Escherichia coli strain Lemo21 (DE3) dengan menggunakan vektor pengekspresan pET-28 selepas dieram semalaman pada suhu 16 oC dan diaruh menggunakan 0.3 mM IPTG. Protein rekombinan AmATS ini didapati memangkin pembentukan alfaterpineol sebagai produk utama apabila menggunakan substrat GPP. Suhu dan pH optimum bagi AmATS ini adalah masing-masing 40 oC dan pH 6.5. Nilai Km dan kcat untuk AmATS ialah masing-masing 8.2 μM dan 5.4 x 10-2 s-1. Kajian ini memberikan maklumat baharu tentang mekanisme biosintesis terpena dalam A. malaccensis seterusnya membentuk pemahaman yang lebih menyeluruh tentang pembentukan gaharu dalam spesies ini.