Kesan asid askorbik sebagai faktor pembezaan osteoblas ke atas sel stem pulpa gigi susu (SHED) dan gigi kekal manusia (DPSC)

Abstract

Sel stem akan membentuk sel osteoblas dalam kehadiran faktor pembezaan osteoblas iaitu asid askorbik dan β-gliserofosfat. Namun, β-gliserofosfat didapati akan merencat proliferasi sel, manakala asid askorbik pula menghasilkan kolagen untuk matriks tulang. Objektif kajian ini adalah untuk menentukan potensi asid askorbik sebagai faktor pembezaan osteoblas bagi sel stem pulpa gigi susu (SHED) dan gigi kekal (DPSC). Sel SHED dan DPSC dipencilkan melalui pendekatan pencernaan enzim. Selepas pengasingan dan pengkulturan, morfologi kedua-dua sel diperhatikan dan masa penggandaan sel (PDT) ditentukan bagi pasaj satu hingga lima. Pasaj yang memberikan nilai PDT terendah bagi kedua-dua sel dipilih bagi eksperimen seterusnya. Asai MTT dilakukan untuk menentukan keupayaan proliferasi sel. Teknik transkripsi berbalik-tindakbalas rantaian polimerase (RT-PCR) dilakukan untuk menentukan pengekspresan beberapa gen penanda sel primitif. Kesan perlakuan asid askorbik pada kepekatan yang berbeza ditentukan menggunakan asai MTT. Keupayaan pembezaan bagi asid askorbik pada sel SHED dan DPSC ditentukan melalui asai MTT, asai enzim, morfologi, pengaktifan penanda molekul osteoblas serta analisis proteom dan sekretom. Kawalan positif merupakan sel SHED dan DPSC yang dikulturkan dalam kehadiran asid askorbik dan β-gliserofosfat. Hasil kajian mendapati bahawa kedua-dua sel mempunyai morfologi menyerupai fibroblas pada lima pasaj pertama. Pasaj 3 memberikan nilai PDT yang terendah bagi SHED dan DPSC sebanyak 43 ± 2.3 dan 63 ± 3.1 jam. Sel SHED dan DPSC berupaya berproliferasi selama 21 hari serta mempunyai profil pengekspresan gen GAPDH+, cKIT+, CD29+, CD73+, CD105+, CD146+, CD11b-, CD34- dan CD45-. Nilai IC50 terendah bagi SHED dan DPSC masing-masing adalah 215.1 ± 1.10 dan 177.6 ± 1.09 μg/mL asid askorbik. Sel SHED dan DPSC masing-masing mengekspreskan enzim ALP selama 21 hari dalam 10-150 μg/mL dan 10-100 μg/mL asid askorbik. Pewarnaan von Kossa pula menunjukkan warna perang bermula pada hari ke-15 dan 18 masing-masing bagi SHED dan DPSC. Kedua-dua sel mengekspreskan gen GAPDH+, RUNX2+, COL 1+, OCN+ dan BSP+ selepas diaruh oleh asid askorbik pada hari ke-21. Analisis proteomik dan sekretomik masing-masing melibatkan perubahan kepada intensiti pengekspresan tujuh proteom dan lima sekretom berkaitan osteoblas dalam 10 μg/mL asid askorbik. Bagi proteom, lima protein sama telah diekspreskan oleh kedua-dua sel. Tambahan pula, alfa-parvin dan protein teras proteoglikan heparan sulfat spesifik membran basement masing-masing adalah penanda molekul protein yang spesifik kepada sel SHED dan DPSC. Bagi analisis sekretom pula, gelsolin, kolagenase jenis IV 72 kDa dan homolog peroksidasin merupakan penanda molekul protein yang spesifik kepada sel SHED, manakala inhibin beta rantai A dan fibrilin-2 merupakan penanda molekul protein yang spesifik kepada sel DPSC. Kesimpulannya, sel SHED mempunyai potensi proliferasi dan pembezaan osteoblas yang lebih tinggi berbanding sel DPSC. Asid askorbik sahaja dapat membezakan sel SHED dan DPSC ke arah osteoblas dalam masa 21 hari menyerupai kesan aruhan kawalan positif. Hasil kajian ini dapat menyumbangkan pendekatan pengkulturan untuk bilangan sel osteoblas yang tinggi untuk aplikasi terapi klinikal. Seterusnya, molekul proteom dan sekretom pula boleh digunakan sebagai penanda pembezaan osteoblas dan diaplikasikan dalam kajian berkaitan penyakit tulang bersasarkan kepada fasa pembentukan tulang yang spesifik.