Kejuruteraan metabolik dan Genom Corynebacterium Glutamicum bagi pertumbuhan sel dan Asimilasi Xilosa daripada biojisim Lignoselulosa

Abstract

Corynebacterium glutamicum merupakan sejenis bakteria Gram-positif dan juga organisma model yang diguna pakai secara meluas dalam penghasilan asid amino dan produk kimia berasaskan bio. Bakteria ini sesuai diguna pakai dalam penghasilan produk berasaskan bio yang mampan dengan menggunakan sumber boleh diperbaharui termasuk gula heksosa (glukosa) dan pentosa (xilosa) yang terdapat dalam biojisim berlignoselulosa terawat. Walau bagaimanapun, strain liar C. glutamicum tidak mampu untuk tumbuh di dalam xilosa disebabkan oleh ketiadaan tapak jalan penggunaan xilosa di dalam sel. Justeru, kajian ini bertujuan untuk membolehkan penggunaan xilosa dalam C. glutamicum dengan pengekspresan rekombinan gen penggunaan xilosa melalui kaedah kejuruteraan mikrob. Analisis in silico telah dijalankan untuk mencari calon gen bagi xilonat dehidratase (xylD) bagi pembinaan tapak jalan penggunaan xilosa Weimberg. Berdasarkan hasil analisis, calon gen xylD daripada Herbasprillum huttiense (hsxylD) telah dipilih bagi pengekspresan berasaskan plasmid dan kromosom di dalam strain C. glutamicum terjurutera. Bagi pengekspresan berasaskan plasmid, gen hsxylD telah diklon kedalam vektor pXMJ19 menggunakan Escherichia coli DH5α sebagai hos pengklonan. Pengekspresan gen hsxylD dikawal atur oleh promoter boleh aruh trc (Ptrc). Melalui kaedah penyusunan Gibson, plasmid rekombinan pXMJ19- cpadh-hsxylD telah berjaya dibina dan kemudiannya disahkan melalui kaedah penjujukan Sanger. Sel elektrokompeten C. glutamicum telah berjaya ditransformasi dengan plasmid rekombinan untuk menghasilkan strain metabolik terjurutera pXMJ19- cpadh-hsxylD. Strain terjurutera pXMJ19-cpadh-hsxylD-C4 menunjukkan kadar pertumbuhan yang cepat di dalam medium minimum R2 bersama 2% xilosa sebagai sumber karbon tunggal dengan mencapai OD600 maksimum 1.88 selepas 48 jam. Analisis HPLC juga menunjukkan bahawa xilosa telah diguna pakai secara menyeluruh

selepas tempoh 48 jam. Bagi pengekspresan berasaskan kromosom, kaset gen Ptrc- hsxylD dan 750 pasangan bes (pb) lengan homolog telah diklon ke dalam plasmid intergrasi pK19mobsacB untuk menyasar promoter gen pengangkut myo-inositol (iolT) di dalam kromosom C. glutamicum. Plasmid pK19-iolT5'-hsxylD-iolT3' yang telah berjaya dibina kemudiannya dimasukkan ke dalam sel elektrokompeten C. glutamicum melalui kaedah elektroporasi. Hasil saringan strain secara rawak menunjukkan bahawa strain genom terjurutera C. glutamicum PiolT::Ptrc::gxylD telah berjaya diperoleh dengan nilai kecekapan penyuntingan sebanyak 36%. Strain terjurutera membolehkan pengekspresan hsxylD bebas plasmid bagi penggunaan xilosa di dalam C. glutamicum. Strain C. glutamicum PiolT::Ptrc::gxylD juga menunjukkan keupayaan untuk tumbuh di dalam xilosa sebagai sumber karbon tunggal. Di samping itu, kedua-dua strain terjurutera menunjukkan pertumbuhan yang lebih baik daripada strain kawalan dan jenis liar di dalam medium R2 yang ditambah dengan 25% hidrolisat batang kelapa sawit sebagai sumber karbon tunggal. Pendekatan kejuruteraan metabolik dan genom yang diguna pakai di dalam kajian ini mampu untuk menjadi pelantar bagi penukaran biojisim berlignoselulosa dan penghasilan produk berasaskan bio yang lebih ekonomi dan mampan di dalam C. glutamicum.