Analisis struktur-fungsi neprosin spesies nepenthes dan pencirian dalam saccharomyces cerevisiae

Abstract

Neprosin merupakan satu protease yang ditemui daripada spesies Nepenthes dengan aktiviti endopeptidase prolil, iaitu pencernaan ikatan peptida selepas residu prolina terminal-C. Walaupun kajian lepas berjaya menunjukkan potensi neprosin bagi terapi pesakit seliak melalui penyahtoksikan gluten yang kaya prolina, kepekatan enzim dalam cecair kendi yang rendah menjadi kekangan aplikasi enzim natif secara langsung. Selain itu, mekanisme pemangkinan neprosin masih belum diketahui. Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk menjelaskan kefungsian neprosin melalui analisis struktur dan pencirian molekul. Analisis in silico telah dijalankan untuk mengenal pasti jujukan neprosin daripada data transkriptomik serta proteomik Nepenthes rafflesiana dan N. ampullaria. Analisis jujukan asid amino famili neprosin tidak menjumpai triad pemangkinan (Ser-Asp-His) endopeptidase prolil S9. Model struktur protein neprosin daripada N. × ventrata (NvNpr) dan N. rafflesiana (NrNpr1) telah dijanakan dengan kaedah ab initio, iaitu RoseTTAFold serta AlphaFold2 dengan MMseqs2. Penjajaran model kepada struktur hablur dalam Bank Data Protein (PDB) menggunakan Distance-matrix ALIgnment (DALI) mendedahkan persamaan struktur dengan peptidase glutamik. Dua residu asid glutamik (Glu60 dan Glu169) yang terpelihara dan stabil berdasarkan simulasi dinamik molekul dijumpai pada tapak aktif putatif neprosin matang, menyokong neprosin sebagai famili protease glutamik yang baharu. Untuk pencirian enzim NrNpr1, pengekspresan NrNpr1 rekombinan (rNrNpr1) dalam hos Escherichia coli telah dijalankan tetapi terbukti mencabar kerana rNrNpr1 tidak larut dengan lipatan yang tidak betul. Lipat semula (refolding) rNrNpr1 tak larut melalui pendekatan atas turus (on-column) ataupun pencairan (dilution) gagal menghasilkan rNrNpr1 yang berfungsi. Pengekspresan dalam Saccharomyces cerevisiae telah berjaya menghasilkan protein rNrNpr1 yang berfungsi. rNrNpr1 yang dirembeskan ke dalam medium kultur telah ditulenkan dengan kromatografi afiniti ion logam pegun (IMAC) menggunakan turus HisTrapTM HP dan sistem AKTA Pure. Untuk pencirian rNrNpr1, asai aktiviti enzim telah dilakukan dengan menggunakan substrat albumin serum bovin (BSA) kerana ia mengandungi ikatan peptida P-Q dan P-E dengan keutamaan pencernaan yang sama bagi pembelahan neprosin. Keputusan SDS-PAGE asai BSA dianalisis dengan perisian ImageJ menunjukkan rNrNpr1 mempunyai julat pH optimum pH 2.5-3.0 serta julat suhu optimum 50-55°C. Selain itu, rNrNpr1 tersebut mempunyai kestabilan terma sehingga suhu 60°C. rNrNpr1 yang ditulenkan juga mampu menjernihkan sluri gliadin selepas pengeraman pada pH dan suhu optimum dalam masa 25 minit. Kajian ini menjadi asas untuk biokejuruteraan yis dengan gen neprosin untuk penghasilan produk makanan bebas gluten ataupun yis probiotik S. cerevisiae var. boulardii untuk pesakit seliak pada masa depan.