Analisis kesan pengekspresan amiR2937 dan amiR854e yang terlibat dalam Arabidopsis thaliana

Abstract

Mikro RNA (miRNA) merupakan ribonukleotida yang tidak mengekod dan bersaiz kecil (19-24 nt) yang bertindak menyenyapkan transkrip sasaran dengan perencatan pasca transkripsi. miRNA mengatur pengekpresan pelbagai mRNA berpotensi yang terlibat dalam proses penting biologi seperti tapak jalan pertahanan dan tindak balas tumbuhan terhadap tekanan biotik atau abiotik. Seterusnya, terpenoid adalah metabolit sekunder (SM) yang mempunyai nilai komersial dalam industri pertanian, farmaseutikal dan makanan. Walaubagaimanapun, pengetahuan tentang mekanisme miRNA dalam mengawal sintesis terpenoid dalam tumbuhan adalah sangat terhad. Objektif kajian ini adalah untuk melihat peranan yang dimainkan oleh miRNA dalam biosintesis terpenoid dengan menggunakan dua miRNA terpilih iaitu miR2937 dan miR854e. Dua miRNA ini telah dipilih berdasarkan transkrip sasaran yang diramalkan iaitu GGPS2 (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase 2) dan TPS13 (Terpenoid Synthase 13). Enzim GGPS2 dan TPS13 terlibat dalam tapak jalan MVA (mevalonat) dan MEP (bukan mevalonat) yang biasanya membekalkan prekursor untuk penghasilan seskuiterpena, triterpena, dan diterpenoid. Enzim GGPS2 di dalam plastid bertindak sebagai pemangkin yang menukarkan prekursor IPP dan DMAPP kepada GGPP. Manakala, enzim TPS13 pula menukarkan prenil difosfat kepada pelbagai subkelas

terpenoid termasuklah diterpena dan seskuiterpena. Oleh itu, dalam kajian ini, kedua- dua miRNA ini telah diekspreskan secara berlebihan dalam tumbuhan A. thaliana dalam

bentuk pengekspresan tunggal dan bersama dengan menggunakan dua vektor iaitu pMDC32b-AtMIR390a-B/c, dan pB2GW7. Sebanyak tiga titisan tumbuhan transgenik A. thaliana yang bersifat homozigot (generasi T3) bagi setiap konstruk telah disaring menggunakan antibiotik higromisin (25 μg/mL) dan BASTA (10 μg/mL), diikuti oleh PCR genomik dengan saiz amplikon 312 pb dan 366 pb. Melalui analisa RT-qPCR, terdapat kawal atur naik gen miR2937 dan gen miR854e dalam kedua-dua tumbuhan transgenik yang mengekspreskan miRNA secara berlebihan. Manakala, kedua-dua enzim, GGPS2 dan TPS13 menunjukkan corak penurunan dalam semua tumbuhan transgenik yang membuktikan bahawa miRNA telah bertindak menindas transkrip sasaran. Analisis SPME-GCMS telah mendedahkan bahawa terdapat pengurangan jumlah fitol dalam semua tumbuhan transgenik tetapi adalah signifikan dalam tumbuhan yang mengekpreskan konstruk miR854e secara berlebihan secara tunggal dan bersama. Sementara itu, terdapat peningkatan jumlah trans-beta-ionone dalam semua tumbuhan transgenik berbanding tumbuhan jenis liar. Konsisten dengan penurunan kandungan fitol, nilai SPAD, dan jumlah kandungan klorofil dalam tumbuhan transgenik, kadar fotosintesis juga menunjukkan corak penurunan dalam tumbuhan transgenik berbanding tumbuhan jenis liar. Terbukti pengekspresan berlebihan kedua-dua miRNA ini boleh menjejaskan jumlah transkrip sasaran yang secara langsung menganggu pertumbuhan tumbuhan. Kajian ini mencadangkan miRNA memainkan peranan dalam pengawalan transkrip sasaran dan berpotensi untuk dimanipulasi bagi menggalakkan atau merencat penghasilan metabolit sekunder dalam A. thaliana.