Analisis proteomik dan ketelapan sel terhadap ketidakfungsian lisosom pada sel endotelium otak manusia (HBEC-5i)

Abstract

Lisosom merupakan organel penting bagi degradasi selular yang diperlukan untuk mengekalkan homeostasis sel. Kegagalannya mengganggu proses degradasi makromolekul dan mendorong perkembangan penyakit Alzheimer (AD). Antara manifestasi klinikal penyakit AD dicirikan dengan ketidakfungsian rintangan darah otak (BBB) akibat pengumpulan protein amiloid pada dinding salur darah otak. Patologi penyakit ini diperantara oleh protein yang mempengaruhi tindakbalas biokimia selular seterusnya menentukan fenotip atau perkembangan penyakit. Justeru, kajian ini membangunkan model ketidakfungsian lisosom bagi mengesan perubahan ekspresi protein serta ketelapan sel endotelium otak yang merupakan komponen utama BBB. Sel endotelium otak manusia (HBEC-5i) dirawat dengan agen lisosomotropik iaitu klorokuin selama 24 jam dan nilai kepekatan rawatan ditentukan dengan asai MTT: IC10 (17.5 μM), IC25 (70.5 μM), dan IC50 (125 μM). Perencatan fungsi lisosom menyebabkan pengumpulan vakuol dalam sel dan analisis imunoasai berasaskan kapilari merekodkan peningkatan signifikan bagi protein penanda autofagi, LC3-II, pada IC25 (p<0.05). Bukan itu sahaja, kepekatan intraselular Aβ42 yang diukur dengan menggunakan ELISA turut mencatatkan peningkatan signifikan pada IC25 (p<0.05). Oleh itu, kepekatan optimum IC25 digunakan pada eksperimen seterusnya. Analisis kromatografi cecair spektrometri jisim (LC-MS/MS) menunjukkan sebanyak 27 protein telah diekspreskan secara signifikan (p<0.05) dengan penurunan ekspresi direkodkan bagi protease lisosom, katepsin B (-3.4) dan katepsin D (-3.8) serta subunit sitokrom oksidase 4I1 (-2.5). Manakala, peningkatan ekspresi telah dicatatkan bagi sequestosom- 1 (+2.4) dan antigen endosom awal 1 (+1.7). Analisis ontologi gen pula merekodkan peningkatan regulasi proses biologi yang melibatkan transkripsi dan apoptosis. Analisis interaksi protein-protein menunjukkan pembentukan 3 kluster protein terutamanya melibatkan proses transkripsi, autofagi dan lisosom. Pengukuran integriti sel monolapisan HBEC-5i menggunakan teknik pengukuran rintangan elektrik transendotelium (TEER) mencatatkan peningkatan ketelapan sel secara signifikan (p<0.05). Kesimpulannya, kajian ini menunjukkan ketidakfungsian lisosom pada sel HBEC-5i mempengaruhi perubahan protein selular berkaitan lisosom, autofagi, endositosis dan mitokondria, serta menjejaskan fungsi rintangan sel endotelium yang boleh menyumbang kepada perkembangan penyakit neurodegeneratif.