PCR jarak jauh: pengoptimuman dan aplikasi ke atas CYP2D6 dalam analisis genotip

Abstract

CYP2D6 merupakan enzim CYP450 utama yang terlibat dalam metabolisme xenobiotik dan bahan endogen. Pengesanan polimorfisme DNA yang mengubah kapasiti pemangkin enzim biasanya memerlukan tindak balas rantai polimerase jarak jauh (PCR) bagi mengelakkan amplifikasi bersama pseudogen yang berkongsi tahap persamaan jujukan yang tinggi dengan gen CYP2D6. Walau bagaimanapun, prestasi PCR yang panjang selalunya dihadkan oleh hasil produk yang rendah yang boleh diatasi dengan penggunaan aditif atau bahan tambahan PCR. Oleh itu, projek ini bertujuan untuk menentukan kesan bahan tambahan PCR yang biasa digunakan ke atas prestasi PCR jarak jauh (dalam format PCR terbuka dan juga dalam emulsi). Projek ini menggunakan teknik dalam ujian berasaskan penjujukan nanoliang untuk genotaip komprehensif gen CYP2D6. Enam bahan tambahan PCR, iaitu betaina, albumin serum lembu(BSA), gliserol, dithiothreitol(DTT), Taq DNA Ligase, dan Trehalosa telah ditambah pada kepekatan yang berbeza ke dalam campuran PCR yang mengamplifikasi serpihan 6.6 kb daripada CYP2D6 dan juga serpihan 10 kb daripada CYP2C19. Serpihan CYP2C19 berbeza dengan ketara dalam kandungan GC daripada CYP2D6. Betaina, DTT, dan Trehalosa didapati meningkatkan PCR apabila ditambah pada 0.8M, 15mM, dan 0.4M masing-masing kepada campuran PCR terbuka. Kesannya adalah konsisten merentas dua sistem PCR berbeza, iaitu AtMax Taq DNA Polymerase dan KAPA LongRange HotStart PCR Kit. Kemudian, ujian penjujukan amplikon nanoliang telah direka untuk genotaip gen CYP2D6 dalam peserta terpilih yang direkrut dalam projek mengenai faktor risiko genetik yang berkaitan dengan penyakit tidak berjangkit dan kesihatan umum. Sebanyak 96 sampel telah dipilih berdasarkan skor kemurungan dan kebimbangan. PCR jarak jauh dijalankan terlebih dahulu untuk menguatkan keseluruhan gen CYP2D6. Produk yang dihasilkan kemudiannya dijujuk menggunakan Flongle (Oxford Nanopore Technologies). Penduaan gen keseluruhan atau alel penghapusan CYP2D6 juga telah digenotipkan oleh PCR jarak jauh multipleks. Kami mendapati bahawa CYP2D6*10 (44%) adalah alel yang paling biasa dijumpai, diikuti oleh CYP2D6*1 (25%), CYP2D6*2 (9%) dan kedua-dua CYP2D6*5 dan CYP2D6*41 pada 8% setiap satu. CYP2D6*5 dan *4 memansuhkan fungsi CYP2D6, manakala CYP2D6*10 dan *41 ialah alel fungsi menurun. Kami memerhatikan bahawa subjek yang mempunyai metabolisme yang lemah atau sederhana (individu yang tidak mempunyai enzim berfungsi sepenuhnya atau kurang ekspresi enzim) mempunyai skor kebimbangan dan kemurungan yang jauh lebih tinggi daripada mereka yang mempunyai fungsi metabolik normal (13.0 vs 6.09, two-tailed t-test, P <0.001). Pemerhatian kami adalah selaras dengan kemungkinan peranan CYP2D6 dalam sintesis dopamin dan serotonin dalam otak. Kajian lanjut mengenai hubungan antara CYP2D6 dan kesihatan mental dalam kohort peserta yang lebih besar adalah perlu untuk menyokong penemuan kami.