Modulasi alfa-tokotrienol ke atas ciri patofisiologi dan profil protein dalam sel neuron matang SH-SY5Y tertransfeksi stabil protein prekursor amiloid sebagai model penyakit Alzheimer

Abstract

SH-SY5Y merupakan sel selanjar neuroblastoma sentiasa membahagi dan tidak memperlihatkan ciri seperti sel neuron. Sel SH-SY5Y yang tertransfeksi stabil dengan gen protein prekursor amiloid (APP) akan menghasilkan protein toksik amiloid-beta (Aβ) dan pembezaannya kepada sel neuron matang boleh digunakan untuk menghasilkan model sel yang mempunyai ciri seperti penyakit Alzheimer (AD). Kajian ini bertujuan untuk mengenalpasti kesan modulasi isomer tokotrienol terpilih ke atas ciri patofisiologi AD iaitu kerosakan DNA, kitar sel, apoptosis serta profil protein dalam model sel neuron matang AD yang dibangunkan daripada sel SH-SY5Y. SH-SY5Y ditransfeksi stabil menggunakan plasmid APP wildtype dan APP swedish/indiana dengan pengesahan dibuat melalui pengekspresan gen dan protein APP serta pengekspresan amiloid-beta (Aβ). Sel tertransfeksi stabil dan sel kawalan tidak tertransfeksi dikultur semasa tahap pra-pembezaan menggunakan 10 μM asid retinoik selama 6 hari. Semasa proses pembezaan pula, sel dikultur pada piring yang disalut Matrigel menggunakan media pembezaaan iaitu media Neurobasal dengan suplementasi B-27 dan ditambah dengan faktor pertumbuhan; faktor neurotrofik terbitan otak (BDNF; 50 ng/mL), neuregulin β1 (NRG; 10 ng/mL), faktor pertumbuhan saraf (NGF; 10 ng/mL) dan vitamin D3 (Vit D3; 24 nM) selama 10 hari. Pembezaan sel diperhatikan melalui perubahan morfologi dan ekspresi protein NeuN digunakan sebagai penanda sel neuron matang. Kesan α-, γ- dan δ-tokotrienol disaring pada 0, 10, 25, 50, 100, 250, 500 dan 1000 nM selama 24 jam menggunakan asai MTS. Sel neuron matang terawat dan tidak terawat dianalisa untuk pengekspresan Aβ42 menggunakan ELISA, kerosakan DNA menggunakan asai komet, pemprofilan kitar sel dan apoptosis menggunakan sitometer aliran serta pemprofilan protein menggunakan kromatografi cecair spektrometri jisim (LCMS/MS). SH-SY5Y telah ditransfeksi stabil dengan plasmid APP wildtype dan APP swedish/indiana. Sel yang membeza mempunyai perubahan dari segi morfologi melalui perencatan pembahagian sel, pemanjangan neurit, dan neurit bercabang. Kehadiran protein NeuN menunjukkan SH-SY5Y telah berjaya membeza menjadi sel neuron matang. Inkubasi dengan α-tokotrienol pada 500 nM selama 24 jam meningkatkan peratus viabiliti sel dalam semua model sel neuron AD. Pengekspresan Aβ42 menurun secara signifikan dalam semua jenis sel neuron matang selepas rawatan dengan α-tokotrienol (p<0.05). Sel neuron matang wildtype terawat dan swedish/indiana terawat juga menunjukkan penurunan dalam kadar kerosakan bebenang ganda dua DNA (p<0.05). . Sel neuron matang wildtype, wildtype terawat dan swedish/indiana terawat menunjukan penurunan dalam peratusan sel positif apoptosis (p<0.05). Analisa proteomik pada perbandingan sel neuron menunjukkan terdapat 1855, 1762, 1214, 2033, 1396 dan 1521 protein terbeza secara signifikan masing-masing dalam perbandingan wildtype vs kawalan, swedish/indiana vs kawalan, swedish/indiana vs wildtype, kawalan vs kawalan terawat, wildtype vs wildtype terawat dan swedish/indiana vs swedish/indiana terawat. Protein yang dikenalpasti terlibat dalam tapak jalan metabolisme tenaga seperti glikolisis dan kitar Kreb, dalam regulasi morfologi seperti panduan akson oleh semoforin dan sitoskeleton oleh Rho GTPase serta dalam regulasi penyakit neurodegeneratif seperti penyakit Parkinson dan penyakit Huntington. Kesimpulannya, α-tokotrienol memainkan peranan dalam mengurangkan ciri patofisiologi AD seperti kepekatan Aβ42, kerosakan DNA bebenang ganda dua dan peratusan sel positif apoptosis serta mengawalatur pengekspresan protein dalam model sel neuron matang SH-SY5Y tertransfeksi stabil dengan APP.