Mekanisme tindakan Tokotrienol terbitan Annatto (AnTT) terhadap pembahagian dan pembezaan sel Pra-Osteoblas MC3T3-E1 melalui analisis biokimia dan pengekspresan gen

Abstract

Pembentukan tulang adalah satu proses penghasilan tulang baru dicirikan dengan pembahagian sel dan pembentukan matrik berkolagen ekstrasel. Apabila sintesis matriks bermula, gen penanda osteoblas akan diaktifkan dalam jujukan bermasa; osteriks (OSX), kolagen 1 alfa 1 (COL1α1), alkalin fosfatase (ALP), dan osteokalsin (OCN). Kemudian, pemineralan bermula dengan pemendapan kalsium dan fosfat untuk membentuk tulang baru. Ketidakseimbangan pembentukan tulang menyebabkan penyakit tulang termasuk osteoporosis. Tokotrienol terbitan annatto (AnTT) daripada biji pokok annatto (Bixa orellana) mengandungi 100% tokotrienol (90% gama tokotrienol dan 10% delta-tokotrienol). AnTT telah ditunjukkan mampu membaiki pembentukan tulang pada haiwan model osteoporosis. Bagaimanapun, kajian terperinci terhadap kesan AnTT ke atas sel pra-osteoblas adalah terhad. Kajian ini bertujuan untuk mengkaji mekanisme tindakan kesan osteogenik AnTT ke atas sel pra-osteoblas MC3T3-E1 mencit. Kepekatan berkesan bagi rawatan AnTT ke atas sel MC3T3-E1 ditentukan berdasarkan kepada viabiliti dan pembahagian sel yang dijalankan masing-masing mengunakan asai MTS dan BrdU. Sel pra-osteoblas dirawat dengan kepekatan AnTT berbeza (0.001 – 1 µg/ml) sehingga 24 hari untuk memerhatikan perubahan morfologi. Pengekspresan penanda pembezaan osteoblas diukur dengan qPCR (OSX, COL1α1, ALP, and OCN) dan dengan asai fluorometrik untuk aktiviti ALP. Pengesanan kolagen dan nodul termineral dilakukan melalui pewarnaan Direct Red, von Kossa dan Alizarin. Bagi kajian mekanisme, statin digunakan sebagai kawalan positif. Aras protein morfogenetik tulang-2 (BMP-2) dan protein terprenilasi, RhoA diukur menggunakan analisis ELISA. Pengekspresan gen 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A (HMG-CoA) reduktase (HMGR) diukur dengan qPCR. Keputusan menunjukkan rawatan AnTT pada kepekatan tinggi menurunkan viabiliti (20 µg/ml) dan pembahagian sel (5 – 20 µg/ml). Perubahan morfologi adalah jelas dari hari 3 sehingga hari 24 dalam semua kumpulan. Gen berkait pembezaan osteoblas seperti OSX, COL1α1, ALP, dan OCN meningkat dengan signifikan dalam kumpulan rawatan AnTT berbanding kawalan bergantung masa (P<0.05). Kolagen jenis 1 meningkat dari hari 3 hingga hari 15 dalam kumpulan rawatan AnTT, manakala aktiviti ALP meningkat dari hari 9 hingga hari 21 dalam kumpulan rawatan AnTT (P<0.05). Pertambahan pemineralan diperhatikan dalam kumpulan rawatan AnTT melalui peningkatan pewarnaan Alizarin daripada hari 3 hingga hari 21 (P<0.05). Protein BMP-2 signifikan meningkat pada kumpulan rawatan AnTT 1 µg/ml dan kumpulan rawatan statin pada hari 15 (P<0.05). Pengaktifan RhoA meningkat secara signifikan pada kumpulan rawatan AnTT 0.1 µg/ml (hari 9) dan kumpulan rawatan statin (hari 9 dan 15) berbanding kawalan (P<0.05). Gen HMGR dikawal atur menurun pada kumpulan rawatan AnTT 0.001 µg/ml (hari 9) dan 0.1 µg/ml (hari 21) berbanding kawalan (P<0.05). Hasil kajian ini mendapati AnTT bertindak merencat pengaktifan RhoA yang menyebabkan peningkatan protein BMP 2. Selain itu, AnTT juga merencat pengekspresan gen HMGR. Tindakan ini menyebabkan peningkatan aktiviti osteogenik dengan meningkatkan ekspresi gen dan protein penanda pembentukan tulang berturutan dan berkait-masa. Sebagai kesimpulan, laluan mevalonat ialah salah satu mekanisme bagaimana AnTT meningkatkan pembentukan tulang.