Pembangunan model sel kornea keratitis acanthamoeba in vitro dan mengkaji kesan khlorheksidina dan ekstrak sarang burung walit

Abstract

Keratitis Acanthamoeba (AK) adalah infeksi kornea yang boleh menyebabkan kebutaan akibat pendedahan secara fizikal terhadap Acanthamoeba spp. yang hidup bebas di persekitaran. Model sel kornea AK boleh dijadikan amalan yang berguna untuk ujian dadah berbanding dengan model kornea arnab. Walaupun AK dapat dirawat dengan antibiotik, namun ubat itu juga menurun kadar penyembuhan luka kornea. Kajian ini bertujuan untuk menjana satu model sel in vitro yang sesuai digunakan dalam ujian kesan khorheksidina dan ekstrak sarang burung walit (EBN) terhadap regenerasi sel epitelium kornea dan keratosit arnab setelah diinfeksi oleh Acanthamoeba. Sepuluh strain klinikal telah diperoleh daripada pengguna kanta sentuh, sementara itu sepuluh strain persekitaran telah dipencilkan dari sumber air dan tanah dari lima tempat rekreasi di Malaysia. Pengenalpastian Acanthamoeba telah dilakukan dengan menggunakan klasifikasi Pussard dan Pons yang berdasarkan kepada morfologi sista dan penjujukan sebahagian 18S rDNA yang melibatkan analisis filogenetika. Model sel AK disediakan dengan pendedahan 1x105 trofozoit Acanthamoeba culbertsoni terhadap sel ekalapis kornea arnab yang tercakar serupa lelasan kornea. Khlorheksidina yang berkepekatan 0µg/ml, 50µg/ml and 100µg/ml ditambahkan selama 6 jam dahulu sebelum digantikan dengan medium kultur sel kornea standard dan medium yang ditambahkan 0.05% ekstrak EBN secara berasingan. Penyembuhan luka ditentukan dengan pengukuran peratusan pembaikan luka, pengekspresan mRNA, pewarnaan imunositokimia dan ELISA. Pengekspresan mRNA penanda degradasi sel (MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-10 dan MMP-12), penanda inflamasi (IL-1α, IL-6 dan IL-8), penanda pembaikan sel epitelium (CK3, CD44 dan fibronektin), penanda pembaikan keratosit [lumican, α-smooth muscle actin 2 (α-SMA2), vimentin dan kolagen jenis 1] serta penanda virulens Acanthamoeba [mannose binding protein (MBP) dan Acanthamoeba laminin binding protein (AhLBP)] ditentukan dengan menggunakan tindakbalas berantai transkripsi berbalik kuantitatif (qRT-PCR). Hasil kajian ini menunjukkan bahawa A. castellanii, A. culbertsoni, A. polyphaga dan A. lenticulata dikenalpasti dari pemencilan strain klinikal dan persekitaran. Semua isolat klinikal tergolong kepada genotip T4, manakala genotip T4 dan T5 dikenalpasti daripada isolat persekitaran. Kultur ceria yang dipencilkan dari klinikal dan persekitaran berkeupayaan untuk melisis semua keratosit selepas tempoh pengeraman bersama selama 24 jam. Strain persekitaran tersebut adalah patogenik dan berpotensi menjadi penyebab jangkitan AK. Kedua-dua jenis sel kornea yang dirawat dengan khlorheksidina yang berkepekatan 50µg/ml dan diikuti oleh pertambahan ekstrak EBN telah menampilkan pembaikan luka yang cepat, penurunan penanda degradasi sel dan inflamasi disamping peningkatan pengekspresan penanda pembaikan sel yang signifikan. Seterusnya, kehadiran protein CK3, CD44, vimentin dan α-SMA2 serta penghasilan protein rembesan IL-1α adalah setanding dengan pengekspresan gen masing-masing untuk kekalkan fenotipnya. EBN berpotensi untuk menggalakkan pembaikan luka kornea dengan mengurangkan tindakbalas inflamasi dan pembentukan paut stroma selepas infeksi Acanthamoeba. EBN juga mengekalkan fenotip sel dan menurunkan risiko jangkitan semula Acanthamoeba melalui penutupan luka yang cepat. Kesimpulannya, model sel kornea AK adalah berguna dan boleh diamalkan untuk ujian dadah.