1. UKM Learning and Research Repository
2. PHD Thesis / Tesis PHD
3. Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Title:	Pencirian endo-β-1,4-mannanase rekombinan daripada trichoderma virens UKM1 dan aspergillus flavus UKM1, serta pembangunan varian β-mannanase stabil suhu
Authors:	Chai Sin Yee (P53404)
Supervisor:	Abdul Munir Abdul Murad, Prof. Madya Dr.
Keywords:	Trichoderma Aspergillus flavus Pathogenic fungi Dissertations, Academic -- Malaysia Universiti Kebangsaan Malaysia -- Dissertations
Issue Date:	8-Jul-2015
Description:	Trichoderma virens dan Aspergillus flavus merupakan kulat patogen yang menghasilkan endo-β-1,4-mannanase dalam penguraian sumber mannan. Penggunaan enzim secara terus daripada kulat patogen dalam industri tidak digalakkan disebabkan oleh kehadiran toksin. Oleh itu, penghasilan enzim dalam hos heterolog adalah kaedah alternatif untuk tujuan keselamatan umum. Objektif kajian ini adalah untuk menciri gen mengekod endo-β-1,4-mannanase daripada kulat pencilan tempatan T.virens UKM1 (manTV) dan A. flavus UKM1 (manAF), menghasilkan β-mannanase rekombinan daripada kedua-dua kulat, menciri sifat biokimia kedua-dua enzim tersebut dan membangunkan enzim terubahsuai melalui mutagenesis terarah tapak (SDM). Jujukan manTV bersaiz 1332 bp dan mengekod 443 asid amino manakala manAF bersaiz 1386 bp dan mengekod 461 asid amino. Protein rekombinan rMANTV dan rMANAF berjaya dihasilkan dalam hos pengekspresan Pichia pastoris dengan berat molekul sekitar 60-65 kDa. Tahap pengekspresan rMANAF (1.3 mg/mL) adalah 6.5-kali lebih tinggi daripada rMANTV (0.2 mg/mL), dengan aktiviti spesifik rMANAF terhadap locust bean gum (LBG) adalah 4117.24 U/mg. Nilai ini adalah 10-kali lebih tinggi daripada rMANTV iaitu 387.26 U/mg. Walau bagaimanapun, rMANTV mencatatkan suhu hidrolisis optimum pada 70°C berbanding dengan rMANAF yang mencatatkan 60°C. Selain itu, rMANTV menunjukkan aktiviti residual melebihi 60% pada 60°C selepas 1 jam manakala rMANAF pula menunjukkan separa hayat 40 minit pada suhu tersebut. Di samping itu, kecekapan katalitik rMANAF (1062.6 ± 96.26 mLmg-1s-1) adalah lebih tinggi daripada rMANTV (225.41 ± 20.14 mLmg-1s-1), walaupun keafinan substrat (Km ) rMANTV terhadap LBG (2.61 ± 0.28 mg/mL) adalah lebih tinggi daripada rMANAF (8.45 ± 1.12 mg/mL). Seterusnya, struktur protein kedua-dua enzim ini diramalkan dengan kaedah pemodelan homologi menggunakan struktur β-mannanase Trichoderma reesei (1QNO) sebagai templat. Perbandingan struktur kedua-dua enzim menunjukkan bahawa MANTV mengandungi satu ikatan disulfida tambahan dalam struktur protein dan tiga tapak N-glikosilasi tambahan pada permukaan protein berbanding dengan MANAF. Sehubungan itu, mutagenesis terarah tapak dilakukan pada gen manAF menurut ciri-ciri tambahan yang diperhati pada MANTV. Sebanyak tiga varian MANAF telah dihasilkan dan ciri-ciri biokimia varian enzim ditentukan. Satu varian ditambah dengan ikatan disulfida tambahan (MANAF-A139C/L142C) dan dua lagi ditambah dengan tapak N-glikosilasi tambahan (MANAF-S245N & MANAF-P274T). Antara ketiga-tiga varian enzim yang dihasilkan, rS245N menunjukkan peningkatan kestabilan suhu dengan separa hayat 50 minit pada 60°C, di samping mengekalkan aktiviti hidrolisis yang tinggi iaitu 3805.53 U/mg terhadap LBG. Varian ini juga menunjukkan peningkatan suhu optimum kepada 70°C. Selain itu, rS245N menunjukkan peningkatan keafinan substrat dan kecekapan katalitik terhadap LBG dengan nilai yang tercatat masing-masing adalah 4.36 ± 0.85 mg/mL dan 1351.07 ± 110.02 mLmg-1s-1. Kesimpulannya, enzim β-mannanase rekombinan rMANTV, rMANAF serta tiga enzim terubahsuai MANAF berjaya dihasilkan dan dicirikan, dengan varian rS245N menunjukkan ciri-ciri biokimia diperbaiki.,Ph.D.
Pages:	243
Call Number:	QR245.C483 2015 tesis
Publisher:	UKM, Bangi
Appears in Collections:	Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.