1. UKM Learning and Research Repository
2. Master Thesis / Tesis Master
3. Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Title:	Pembangunan varian kutinase glomerella cingulata untuk meningkatkan pempartisiannya dalam pemisahan terma sistem dua fasa berakuas
Authors:	NurKamilah Isha (P55951)
Supervisor:	Farah Diba Abu Bakar, Prof Madya Dr
Keywords:	Varian kutinase glomerella cingulata
Issue Date:	18-Nov-2014
Description:	Proses industri dalam bidang biokatalisis sering melibatkan proses yang kasar dan penggunaan suhu yang tinggi. Penggunaan protein rekombinan yang tahan suhu tinggi dan penghasilan protein yang berkos rendah serta berisipadu tinggi dapat memenuhi permintaan pasaran industri bioteknologi. Penggunaan protein rekombinan yang stabil suhu tinggi dan pengekstrakan protein melalui sistem dua fasa berakuas (ATPS) boleh memenuhi kriteria ini. Dalam kajian ini, dua varian enzim rekombinan kutinase Glomerella cingulata, kutinase-N177D dan kutinase-L172K/N177D yang tahan suhu tinggi berbanding kutinase natif telah dilakurkan dengan peptida hidrofobik pada penghujung-C untuk meningkatkan pemisahannya di dalam pemisahan terma sistem dua fasa berakuas (ATPS). Serpihan cDNA yang mengekodkan varian kutinase G. cingulata matang, kutinase-N177D dan kutinase-L172K/N177D telah dijuruterakan secara genetik dengan jujukan yang mengekod penanda hidrofobik TGGSGG-(WP)4 melalui tindak balas berantai polimerase (PCR). cDNA ini disubklonkan ke dalam vektor pengekspresan pPICZαC, menghasilkan pPICZαC-kutinase-N177D-TGGSGG-(WP)4 dan pPICZαC-kutinase-L172K/N177D-TGGSGG-(WP)4 yang seterusnya digunakan dalam transformasi hos pengekspresan Pichia pastoris strain X-33. Aruhan metanol terhadap transforman positif P. pastoris telah dapat mengekspreskan protein ekstrasel rekombinan sasaran bersaiz ~22 kDa. Sebagai perbandingan, kutinase natif berpenanda hidrofobik, kutinase-TGGSGG-(WP)4 turut diekspreskan di dalam P. pastoris strain X-33. Kutinase-TGGSGG-(WP)4, kutinase-N177D-TGGSGG-(WP)4, dan kutinase-L172K/N177D-TGGSGG-(WP)4 telah menunjukkan aktiviti enzim yang optimum pada pH 8 dan stabil pada julat pH antara 5 hingga 11. Aktiviti kutinase-TGGSGG-(WP)4 adalah optimum pada suhu 25°C dan stabil sehingga suhu 35°C. Kutinase-N177D-TGGSGG-(WP)4 dan kutinase-L172K/N177D-TGGSGG-(WP)4 juga menunjukkan aktiviti optimum pada suhu 25°C tetapi aktivitinya adalah stabil sehingga suhu 45°C. Kutinase-L172K/N177D-TGGGG-(WP)4 menunjukkan aktiviti yang paling tinggi pada suhu optimumnya. Enzim-enzim ini kemudiannya telah dimasukkan ke dalam ATPS untuk membandingkan keupayaan sistem dua fasa dalam pemerolehan primer kutinase bagi setiap varian. Dalam kajian ini, kopolimer pemisahan terma hidrofobik iaitu, etilena oksida dan propilena oksida, EO-PO, dan kanji digunakan. Hampir kesemua kutinase terpisah ke dalam fasa EOPO seperti yang dikehendaki. Dalam langkah pengekstrakan kedua, apabila fasa EO-PO dipanaskan pada suhu 34°C, kutinase varian dan natif telah dapat diekstrak semula daripada fasa EO-PO ke dalam fasa akuas yang hampir tulen. Nilai pekali pempartisian K, kutinase-L172K/N177D-TGGSGG-(WP)4, kutinase-N177D-TGGGG-(WP)4 dan kutinase-TGGSGG-(WP)4 pada langkah pengekstrakan pertama ialah 1.7, 2.95 dan 1.24 masing-masing. Varian kutinase-L172K/N177D-TGGSGG-(WP)4 telah menunjukkan aktiviti spesifik yang tertinggi selepas pengekstrakan di dalam ATPS iaitu 219.5 U/mg, diikuti oleh kutinase-N177D-TGGGG-(WP)4 iaitu 209.8 U/mg dan kutinase-TGGSGG-(WP)4 iaitu 69.48 U/mg. Sebagai kesimpulan, varian tahan suhu kutinase-N177D-TGGSGG-(WP)4 dan kutinase-L172K/N177D-TGGSGG-(WP)4 telah berjaya mempartisi dengan lebih cekap ke fasa yang dikehendaki di dalam pemisahan terma ATPS berbanding kutinase, kutinase-TGGSGG-(WP)4.,Master/Sarjana
Pages:	158
Publisher:	UKM, Bangi
Appears in Collections:	Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.