1. UKM Learning and Research Repository
2. Master Thesis / Tesis Master
3. Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Title:	Penjanaan varian endoglukanase A (EglA) daripada Aspergillus niger melalui PCR-cenderung ralat (ep-PCR)
Authors:	Nurulermila binti Minor (P 48536)
Supervisor:	Farah Diba Abu Bakar, Dr.
Keywords:	Penjanaan varian endoglukanase A (EglA) Aspergillus niger PCR-cenderung ralat (ep-PCR) Recombinant proteins
Issue Date:	8-Mar-2013
Description:	Endoglukanase A (EglA) merupakan salah satu komponen utama penguraian selulosa oleh Aspergillus niger dan dikategorikan di dalam famili 12 glikosil hidrolase. Jujukan lengkap cDNA eglA telah diamplifikasi dan diklon ke dalam vektor pengekspresan, pET32b. Protein telah diekspreskan melalui sistem pengekspresan Escherichia coli Origami DE3 menggunakan keadaan yang telah dioptimumkan iaitu pada suhu 20oC, 130 p.s.m. dan masa aruhan 24 jam dengan aruhan menggunakan 0.02 mM IPTG. Seterusnya, EglA ditulenkan menggunakan kromatografi keafinan ion logam terpegun (IMAC) dan dicirikan secara biokimia. Hasil pencirian menunjukkan bahawa EglA rekombinan ini mempunyai suhu dan pH optimum masing-masing pada 50oC dan 4. Protein rekombinan didapati stabil pada julat suhu 20oC hingga 50oC dan pada pH 3 hingga 6. Nilai Km EglA rekombinan bagi substrat β-glukan yang lebih rendah berbanding dengan substrat karboksimetilselulosa (CMC) menunjukkan bahawa protein ini mempunyai keafinan yang lebih tinggi terhadap β-glukan berbanding CMC dengan nilai Km masing-masing 28.06 mgmL-1 dan 71.96 mgmL-1. Aktiviti hidrolitik EglA rekombinan ditingkatkan oleh ion Mn2+ dengan kesan peransangan lebih daripada 150%, manakala aktiviti direncat oleh ion Cu2+ dan sodium dodesil sulfat (SDS) dengan kesan perencatan sebanyak lebih daripada 60%. Seterusnya, perpustakaan DNA varian eglA bersaiz 5000 klon telah dibina melalui PCR-cenderung ralat (ep-PCR). Frekuensi mutasi bagi perpustakaan ini telah dikaji melalui penjujukan dan hasil menunjukkan bahawa 19% klon daripada perpustakaan tidak mempunyai sebarang mutasi, 57% dengan satu mutasi titik, 14% dengan dua mutasi titik, 5% dengan tiga mutasi titik dan 5% lagi dengan empat mutasi titik. Kesemua varian eglA daripada perpustakaan DNA kemudiannya diekspreskan dan setelah itu disaring dengan menggunakan kaedah penyaringan berasaskan piring mikrotiter. Salah satu varian enzim daripada penyaringan ini menunjukkan kestabilan yang lebih tinggi pada pH berasid berbanding dengan enzim jenis induk. Hasil penjujukan menunjukkan bahawa varian eglA ini mempunyai dua mutasi titik yang menyumbang kepada penggantian dua asid amino dan oleh itu, varian ini dinamakan sebagai Q26H/S173R. Pencirian biokimia ke atas varian tersebut menunjukkan bahawa ia mempunyai ciriciri yang agak sama seperti EglA rekombinan. Walau bagaimanapun, ia menunjukkan perbezaan ketara dalam kestabilan pada pH berasid, di mana ia mampu mengekalkan sebanyak ~80% aktiviti relatif pada pH 2 melalui penentuan peratusan nilai aktiviti spesifik pada pH 2 per aktiviti spesifik tertinggi yang direkodkan pada pH optimum, 4. Sebaliknya, EglA rekombinan tidak menunjukkan sebarang aktiviti pada pH 2.,Master/Sarjana
Pages:	156
Call Number:	TP248.65.P76.N847 2013
Publisher:	UKM, Bangi
Appears in Collections:	Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.