1. UKM Learning and Research Repository
2. Master Thesis / Tesis Master
3. Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Title:	Pengekspresan dan pencirian endoglukanase I rekombinan daripada Trichoderma reesei
Authors:	Amelia Suhana Zamri (P38596)
Supervisor:	Farah Diba Abu Bakar, Dr
Keywords:	Fungi Trichoderma
Issue Date:	1-Mar-2012
Description:	Kulat berfilamen Trichoderma reesei menghasilkan antara sistem selulase yang paling berkesan untuk menghidrolisis bahan selulosa kepada gula monomer. Keadaan ini dicapai melalui tindakan bersama enzim-enzim selulase yang terdiri daripada endoglukanase, selobiohidrolase dan β-glukosidase. Dalam kajian ini, enzim endoglukanase rekombinan dihasilkan oleh yis metilotrofik, Pichia pastoris untuk menghidrolisis bahan buangan selulosa iaitu, tandan kosong kelapa sawit (TKKS) kepada poliosa. Jujukan lengkap cDNA eglI daripada T. reesei strain M5 telah diamplifikasi dengan menggunakan PCR transkriptase berbalik dan diklon ke dalam vektor pengklonan, pGEMT-Easy. Seterusnya, cDNA eglI yang mengekod protein endoglukanase matang (EglI) diklon ke dalam vektor pengekspresan ekstrasel, pPICZαC dan ditransformasi ke dalam hos pengekspresan P. pastoris strain X-33. Transforman yis disaring untuk kerintangan Zeocin berdasarkan kepada kebolehan koloni-koloni untuk hidup pada kepekatan Zeocin yang tinggi (2000 μg/mL). Sebanyak 35 % daripada transforman yis mengandungi kaset pengekspresan gen endoglukanase bersalinan tinggi telah diperoleh. Saiz jangkaan protein rekombinan sasaran adalah 53 kDa, walau bagaimanapun, analisis SDS-PAGE dan pemblotan Western menunjukkan protein ekstrasel yang terhasil bersaiz lebih besar daripada 80 kDa; ini berkemungkinan menunjukkan bahawa protein EglI mengalami glikosilasi terangkai-N. Seterusnya, pencernaan EglI dengan enzim deglikosilase, N-glukosidase PNGase dan Endo Hf menyokong bahawa EglI mengalami glikosilasi terangkai-N. EglI terlakur penanda polihistidina ini ditulenkan dengan menggunakan kromatografi afiniti dan hasil protein tertulen EglI terbitan P. pastoris adalah sebanyak 3 mg/L. Pencirian EglI rekombinan menunjukkan bahawa aktiviti enzim yang optimum adalah pada suhu 50°C dan pH 5. Enzim EglI rekombinan adalah termostabil kerana ia masih mengekalkan lebih daripada 70% aktiviti residual apabila dieramkan pada suhu 50°C (pH 5) selama 20 jam dan lebih daripada 50% aktiviti residual selepas 42 jam pengeraman. Nilai Km EglI bagi substrat, karboksimetilselulosa (CMC) adalah lebih rendah berbanding β-glukan. Ini adalah kerana EglI mempunyai keafinan yang tinggi terhadap CMC dengan nilai Km, 16.96 mg/mL manakala nilai Km EglI terhadap β-glukan adalah 22.53 mg/mL. Enzim EglI aktif pada julat pH yang luas (antara pH 4.0-7.0), manakala penurunan aktiviti dapat dilihat apabila suhu meningkat daripada 60 hingga 80°C. Kehadiran EDTA, ion-ion Fe3+, Zn2+ dan Cu2+ merencatkan aktiviti EglI, manakala ion-ion Mn2+ and K+ menjadi pengaktif kepada EglI yang merangsangkan aktiviti hidrolitik enzim sebanyak dua kali ganda. Endoglukanase I seterusnya digunakan dalam hidrolisis TKKS yang telah dilakukan pra-rawatan. Campuran EglI rekombinan telah ditambahkan dengan enzim selulase komersil, Celluclast™, yang komponen utamanya adalah eksoselulase. Pada nisbah enzim 1:1, EglI berupaya menghidrolisis TKKS dengan jumlah gula penurun tertinggi sebanyak 12% gula penurun per mg TKKS pada suhu 50°C dan pH 5. Oleh itu, kajian pengekspresan dan pencirian biokimia endoglukanase I rekombinan telah berjaya dibangunkan dan ia berpotensi untuk diaplikasikan sebagai enzim tambah dalam meningkatkan kecekapan tindak balas pencuraian TKKS.,Tesis ini tiada perakuan deklarasi pelajar,Sarjana Sains
Pages:	197
Call Number:	QK600.476.A467 2012 tesis
Publisher:	UKM, Bangi
Appears in Collections:	Faculty of Science and Technology / Fakulti Sains dan Teknologi

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.