Rungkaian tapak jalan biosintesis dan penghasilan alkaloid indol mitragyna speciosa dengan menggunakan integrasi pendekatan metabolomik dan transkriptomik

Abstract

Mitragyna speciosa Korth. Havil. (Rubiaceae) adalah tumbuhan psikoaktif dengan potensi terapeutik yang tinggi. M. speciosa digunakan untuk merawat banyak penyakit seperti demam, cirit-birit, diabetes, sindrom sarak opiat, sakit kronik dan keletihan fizikal. Sifat ubatan ini sering dikaitkan dengan kehadiran alkaloid monoterpenoid indol (MIA), terutamanya mitragynine (MG) dan 7-hydroxymitragynine (7-OHMG). Sehingga kini, terdapat 58 alkaloid yang telah dikenal pasti daripada M. speciosa, tetapi masih belum ada kajian sistematik perbandingan kandungan alkaloid di dalam daun. Malah, tapak jalan biosintesis MIA juga kurang difahami kerana kekurangan maklumat molekul untuk mengenal pasti gen yang terlibat. Oleh itu, pendekatan metabolomik digabungkan dengan transkriptomik de novo telah dilaksanakan bagi membandingkan daun muda dan daun matang M. speciosa untuk mengkaji kesan kematangan daun pada komposisi alkaloid, serta membantu dalam pembinaan tapak jalan biosintesis MIA. Pemprofilan metabolit bukan sasaran dijalankan ke atas ekstrak metanol daun M. speciosa untuk analisis kromatografi cecair-pengionan semburan elektro-masa penerbangan-spektrometri jisim (LC-ESI-TOF-MS). Ini menghasilkan sejumlah 93 metabolit putatif yang merangkumi pelbagai kumpulan metabolit sekunder termasuk alkaloid, asid karboksilik, glukosida, fenol, fenilpropanoid, terpenoid, flavonoid dan aldehid fenolik. Corak taburan metabolit antara kumpulan daun muda dan matang kemudiannya diproses menggunakan analisis statistik univariat dan multivariat. Terdapat 68 alkaloid termasuk 50 alkaloid putatif dan 14 subkelas alkaloid baru yang belum pernah dilaporkan dalam M. speciosa. Pengkuantitian relatif menunjukkan bahawa keamatan MG dan 7-OHMG masing-masing adalah 1.2 dan 3.6 kali ganda lebih banyak dalam daun matang berbanding dengan daun muda. Selain itu, akuammidine, alstonina, sefarantina, 10-hydroxycamptothecin, 7-O-nicotinoylscutebarbatine H dan yohimbina adalah antara alkaloid yang dilaporkan buat pertama kali dalam M. speciosa yang mungkin menyumbang kepada sifat farmakologi M. speciosa dalam pengurusan kemurungan, barah dan diabetes. Analisis transkriptom daun muda dan matang telah dijalankan dan menemui 102,288 unigen. Sebanyak 2,135 unigen yang mengekod 54 famili faktor transkripsi (TF) juga telah dikenal pasti. Antara beberapa famili TF yang terlibat dalam biosintesis MIA ialah bHLH, MYB-related, C2H2, ERF, MYB, WRKY dan AP2. Analisis pengekspresan gen antara daun muda dan matang pula telah mengenal pasti 7,365 unigen yang merupakan gen terekspres secara berbeza (DEG). Sebanyak 47 gen calon yang terlibat dalam tapak jalan biosintesis MIA telah dikenal pasti, termasuk strictosidine synthase (STR) dan strictosidine β-D-glucosidase (SDG) yang penting untuk biosintesis perantaraan dalam penghasilan MG dan 7-OHMG. DEG terpilih yang terlibat dalam tapak jalan biosintesis MIA disahkan melalui kaedah RT-qPCR. Selain itu, 12 alkaloid yang dikenal pasti melalui analisis metabolomik telah dipetakan dalam tapak jalan biosintesis MIA sebagai hasil integrasi metabolomik dan transkriptomik. Kajian ini telah menemui 29 gen baru dalam biosintesis MIA M. speciosa. Kesan kematangan daun terhadap gen tapak jalan biosintesis MIA juga telah ditunjukkan. Kajian ini memberikan pemahaman yang lebih mendalam mengenai komposisi dan kuantiti MIA dalam daun muda dan matang, serta menyumbang dalam melengkapkan tapak jalan biosintesis MIA M. speciosa.