Pencirian enzim neprosin daripada spesies nepenthes rafflesiana

Abstract

Enzim protease telah digunakan secara komersial untuk aplikasi bioteknologi seperti industri pemprosesan makanan, industri detergen dan perubatan. Kajian lepas melaporkan kehadiran enzim dengan aktiviti endoprotease prolil (PEP), iaitu neprosin yang dirembes ke dalam cecair kendi Nepenthes × ventrata. Nepenthes merupakan genus tumbuhan karnivor tropika yang hidup berbekalkan nutrien daripada pencernaan serangga yang diperangkap dalam kendi oleh rembesan enzim hidrolisis. Penemuan enzim neprosin yang mampu menyahtoksik gluten berpotensi untuk terapi penyakit seliak kerana keupayaannya untuk mengurai α-gliadin. Penyakit seliak adalah disebabkan ketidakupayaan protease gastrik untuk mencerna gluten secara menyeluruh dan menyebabkan keradangan usus bagi individu yang sensitif terhadap gluten. Pendekatan rekombinan diperlukan untuk mengatasi kandungan neprosin yang rendah dalam cecair kendi bagi kajian lanjutan dan aplikasi industri. Kajian ini bertujuan untuk mencirikan dua homolog neprosin daripada Nepenthes rafflesiana (Npr), iaitu neprosin-1 (Nr1) dan neprosin-2 (Nr2) yang ditemui daripada kajian transkriptom melalui analisis bioinformatik dan pengekspresan rekombinan. Analisis bioinformatik telah dijalankan untuk meramal ciri fisikokimia menggunakan EMBOSS Pepstats, InterPro dan PfamScan. Ramalan struktur tiga dimensi (3D) protein secara ab initio dijalankan menggunakan RoseTTAFold dan AlphaFold2 melalui Google Colab. Model ramalan dengan skor tertinggi digunakan untuk analisis CASTp untuk meramal tapak pengikat substrat. Analisis penjajaran struktur protein menggunakan DALI menemui protein famili peptidase glutamik dalam Protein Data Bank (PDB). Pengedokan enzim dan substrat αI-gliadin telah dijalankan menggunakan PatchDock dengan padanan yang tinggi. Bagi pengekspresan neprosin rekombinan, jujukan sintetik Nr1 dan Nr2 yang teroptimum kodon telah diklon ke dalam vektor pET-28b(+) tanpa peptida isyarat dan ditransformasi ke dalam sistem pengekspresan Escherichia coli Lemo21(DE3). Pengekspesan protein pada suhu 37oC selama 4 jam aruhan IPTG 1 mM yang diekstrak menggunakan penimbal Tris-HCl (pH 8) mendapati neprosin rekombinan tidak larut pada saiz yang diramalkan, iaitu 40.5 kDa untuk Nr1 dan 38.7 kDa untuk Nr2. Oleh itu, ekstrak neprosin rekombinan (Nr1) telah dilarutkan dengan penambahan urea dalam penimbal sebelum pelipatan semula dan penulenan protein menggunakan kolum nikel. Hasil kajian pencirian enzim neprosin daripada spesies Nepenthes ini diharapkan dapat menyumbang kepada kajian lanjutan bagi aplikasi enzim tumbuhan dalam terapi penyakit seliak dan industri pemprosesan makanan.